Inflammatory extracellular vesicle subpopulations as potential cardiovascular disease biomarkers

Abstract

Cardiovascular diseases (CVD) are inflammation-associated diseases with a long asymptomatic period. Though a lot of research has been done in this field, there is still no accurate personalized diagnosis/prognosis available. Indeed, a 10-year risk for developing CVD can be estimated but often fails to assess the risk accurately for individual patients. Therefore, more accurate tools and new biomarkers are required in order to improve CVD risk assessment. Extracellular vesicles (EV) are emerging players in therapeutics and diagnostics. EV are small (submicron) sized lipid membrane enclosed vesicles originating from all types of cells in the body. EV contain biomolecular information such as lipids, proteins and nucleic acids and are present in homeostasis as well as in diseases. Furthermore, the state of the cell of origin is reflected in their secreted EV. In this research, we aim to take the first steps upon identifying inflammation associated EV subpopulations which have a potential as CVD biomarkers. This thesis targets three challenges in the EV field related to the identification of disease-associated EV. These challenges are addressed in three separate chapters. (1) Selection of appropriate isolation methods for EV derived from cell cultures and of blood plasma. (2) The identification of single EV profiles and their EV subpopulations based on surface markers using a fluorescence microscopy based single burst analysis (SBA) method. (3) The isolation and characterization of inflammation associated EV subpopulations. A selection and optimization of appropriate EV isolation and characterization methods for EV derived from cell conditioned medium and plasma was achieved according to the MISEV guidelines (chapter 2). EV are enriched from cell conditioned medium using a single step size exclusion chromatography (SEC) isolation method. Furthermore, EV are derived from blood plasma using a two-step isolation procedure combining SEC with density gradient ultracentrifugation. These isolation methods were assessed according to the MISEV guidelines using western blotting for determining the classical EV markers, nanoparticle tracking analysis (NTA) to determine the size and concentration of EV and transmission electron microscopy to visualize the morphology of individual EV. Conventional EV characterization methodologies usually address bulk EV preparation and fail to grasp the heterogeneity present in an EV sample. In the second part of this thesis, fluorescence confocal microscopy and single burst analysis (SBA) was used and combined with machine learning techniques (chapter 3). This innovative approach allows the detection of single fluorescently labeled EV. We showed that this application can be used as a fast and straightforward alternative to assess EV sample quality according to the MISEV guidelines. More importantly, we showed that multiple labels can be used to detect multiple biomarkers on a single EV. We demonstrated that this innovative technology can detect the presence of lipoproteins by using apolipoproteina-1 (APOa1) as a marker in EV derived plasma samples. Furthermore, we showed that intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) specific EV subgroups, released by inflamed endothelial cells, can be classified and clustered into specific EV subpopulations by applying machine learning approaches to and SBA of triple labeled (anti-CD63, anti-CD9 and anti-ICAM-1) EV preparations. The proposed methodology can be widely applied on standard confocal microscopes, thereby allowing both standardized quality assessment of patient plasma EV preparations. Even more importantly, this approach can be applied to determine diagnostically relevant EV profiles by identifying multiple biomarkers on a single EV. The use of an EV-based biomarker is challenging due to the heterogeneity of EV samples. The proposed SBA technology allows the identification of EV subpopulations, but can only be applied using known biomarkers. In the last part of this thesis, monomeric C-reactive protein (mCRP) was evaluated as a potential novel EV associated biomarker (chapter 4). We demonstrated that upon TNF-α stimulation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) do secrete mCRP(+)EV. We showed that the mCRP(+) EV subpopulation released from these inflamed HUVEC displays a distinct inflammatory protein profile. Moreover, these mCRP(+) EV inflammation in the targeted endothelial cells as demonstrated by the increased ICAM-1 levels in the target cells and the increased adhesion of monocytes to these activated endothelial cells. Further research of such distinct inflammation associated EV subpopulations may provide novel insights in their role on the initiation or propagation of CVD. The results described in this thesis provide novel opportunities for the identification and use of distinct inflammatory EV subpopulations as relevant biomarkers for the detection of early inflammation and possibly the origin of inflammation associated diseases such as CVD.

Hart- en vaatziekten of cardiovasculaire ziekten zijn ziekten geassocieerd met een lange asymptomatische inflammatoire periode. Ondanks uitvoerig onderzoek in dit veld, is er nog steeds geen accurate en gepersonaliseerde diagnose/prognose mogelijk. Men kan het 10-jarig risico op de ontwikkeling van cardiovasculaire zieken inschatten, maar dit faalt vaak voor individuele patiënten. Hierdoor is er nood aan verbeterde methoden en nieuwe biomerkers. Extracellulaire vesikels (EV) zijn een nieuwe opkomende speler voor toepassingen in diagnose en therapie. Dit zijn kleine (submicron) lipide-gebaseerde gesloten vesikels afkomstig van alle cellen in het lichaam. Ze bevatten biomoleculaire informatie zoals lipiden, proteïnen en nucleïne zuren en zijn aanwezig in homeostase en ziekte. De fysiologische status van de cel wordt gereflecteerd in de gesecreteerde EV. Het doel van dit onderzoek is het identificeren van inflammatie-geassocieerde EV subpopulaties. Deze thesis behandelt drie grote uitdagingen in het EV veld gerelateerd aan de identificatie van ziekte-gerelateerde EV in drie aparte hoofdstukken. (1) Selectie van een aangepaste isolatie methode voor EV afkomstig van celkweek en van bloed plasma. (2) De identificatie van individuele EV profielen en EV subpopulaties gebaseerd op hun oppervlaktemerkers met behulp van een fluorescentiemicroscopie gebaseerde single burst analyse (SBA) methode. (3) De isolatie en karakterisatie van zulke mogelijke inflammatie geassocieerde EV subpopulaties. Een selectie en optimalisatie van de EV isolatie en karakterisatie methoden voor EV komende van cel geconditioneerd medium en plasma werd uitgevoerd volgens de MISEV richtlijnen (hoofdstuk 2). Hierbij werd voor EV van cel geconditioneerd medium size exclusion chromatography (SEC) als methode geselecteerd. Voor de isolatie van EV uit plasma werd gekozen voor een combinatie van SEC en dichtheidsgradient-ultracentrifugatie. De geschiktheid van deze methodes werd gekarakteriseerd volgens de MISEV richtlijnen met behulp van western blotting voor de klassieke EV merkers, nanoparticle tracking analysis (NTA) voor het determineren van de grootte en concentratie van de aanwezige EV en daarnaast transmissie electronen microscopie om individuele EV te visualiseren. Deze isolatie en karakterisatie procedures werden vervolgens toegepast voor de verdere experimenten beschreven in deze thesis. Huidige methodologieën om EV te karakteriseren zijn meestal gericht op bulk analyse en kunnen daardoor de heterogeniteit van een EV staal niet in kaart brengen. In het 2de luik van de thesis werd fluorescentie confocale microscopie en single burst analyse (SBA) gecombineerd met machine learning technieken (hoofdstuk 3). Deze innovatieve benadering maakt het mogelijk om individuele fluorescent gelabelde EV te detecteren. Zo toonden we aan dat deze applicatie een snel en eenvoudig alternatief kan vormen voor de noodzakelijke kwaliteitscontrole van EV preparaten volgens de geldende MISEV richtlijnen. Nog belangrijker, toonden we aan dat meervoudige labels als één-molecuul burst analyse microscopie kan gebruikt worden om meerdere biomerkers op een individueel EV te detecteren. De bruikbaarheid van deze innovatieve technologie werd gedemonstreerd door de aanwezigheid van lipoproteïnen als typische contaminant te meten, gebruikmakende van apoliproteïnea-1 (APOa1) als merker, in verschillende types van plasma EV preparaten. Daarnaast toonden we aan dat intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) specifieke EV subpopulaties, die gesecreteerd worden door inflammatoire endotheelcellen, via drievoudige labeling (CD63, CD9 en ICAM-1) kunnen opgesplitst worden in specifieke subpopulaties door toepassing van machine learning technieken. De voorgestelde methodologie kan gebruikt worden op standard confocale microscopen en laat een gestandaardiseerde kwaliteitsbeoordeling van patiënten plasma EV preparaten toe. Nog belangrijker, kan deze innovatieve benadering ingezet worden om diagnostisch relevante EV profielen, aan de hand van meerdere biomerkers op één individueel EV, te identificeren. Het is duidelijk dat het gebruik van een EV-gebaseerde biomerkers complex is vanwege de heterogeniteit van EV stalen. De voorgestelde SBA technologie laat toe om individuele profielen te identificeren, maar kan uiteraard enkel toegepast worden met gekende biomerkers. In het laatste deel van de thesis werd daarom mCRP als een potentiële nieuwe EV geassocieerde biomerker geëvalueerd (hoofdstuk 4). We toonden aan dat inflammatoire endotheelcellen, bekomen door TNF-α stimulatie van human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), inderdaad monomeer C-reactieve proteïne (mCRP)(+) EV secreteren. Deze EV subpopulatie blijkt een uniek patroon aan inflammatie geassocieerde proteïnen te bevatten en bovendien is deze mCRP(+) EV subpopulatie in staat om inflammatie te induceren in doelwit endotheelcellen zoals werd aangetoond aan de hand van een verhoogde ICAM expressie en de verhoogde binding van monocyten aan deze geactiveerde endotheelcellen. De verdere studie van deze unieke inflammatie gerelateerde EV subpopulaties kunnen nieuwe inzichten opleveren over hun rol in de initiatie van hart-en vaatziekten. De resultaten van deze thesis vormen een belangrijke aanzet tot het identificeren en het gebruiken van unieke inflammatoire EV subpopulaties als relevante biomerker voor de detectie van vroege inflammatie en het mogelijk ontstaan van geassocieerde aandoeningen zoals cardiovasculaire ziekten.