Detectie van labelvrije targetmoleculen door middel van optisch uitleesbare, antilichaam gebaseerde biosensoren

Abstract

Het onderzoek naar biosensoren is een ‘hot topic’ in de biomedische sector. Dit project draagt hiertoe bij door een labelvrije, aan de target kant, optische immunosensor te ontwikkelen. Met behulp van deze methode kan de antilichaambinding geoptimaliseerd worden en de verkregen kennis kan gebruikt worden om de gevoeligheid van immunosensoren in het algemeen te verhogen. Het principe van de optische immunosensor is gebaseerd op ‘Fluorescence resonance energy transfer’ (FRET). Met deze techniek kan niet enkel de oppervlakteverdeling van de antilichamen bestudeerd worden door middel van fluorescentie, maar gelijktijdig hun functionaliteit gecontroleerd worden. Preliminaire metingen van fluorescent gelabelde antilichaam – proteïne G complexen werden uitgevoerd op de fluorimeter en platereader. Nadat een optimalisatie van de labelingsgraad en proteïne concentratie bekomen was met behulp van de fluorimeter, werd overgegaan op de detectie van FRET. Dit fenomeen diende enkel op te treden wanneer er antilichaam-antigen interactie plaatsvond. Deze eerste constructen bleken echter moeilijk te reproduceren en vereisten tijdsrovende optimalisatie stappen. Om deze redenen werd besloten om over te stappen op een alternatieve methode. Met behulp van recombinante DNA technologie is het mogelijk om antilichamen te voorzien van korte tags, waaraan via een enzymatische reactie fluorescente groepen gehecht kunnen worden. Deze methode vereist het eigenhanding isoleren, modificeren en recombinant kloneren van DNA maar maakt een controleerbare en reproduceerbare antilichaam labeling mogelijk. Er werd mRNA van verschillende hybridoma cellijnen van Balb/C muizen vrijgegeven om recombinante antilichamen te producere. De voorlopige resultaten van de cDNA, PCR amplificatie, transformatie en plasmide sequentie bepaling waren veelbelovend. Na de samenstelling van een kloneringsvector kunnen recombinant aangemaakte antilichamen in de toekomst gebruikt worden voor een nieuw type optische immunosensor te creëren. Met een stabielere fluorescente labeling kan het optreden van FRET vastgesteld worden. Vervolgens kunnen functionaliteits metingen en oppervlakte karakterisatie verbeterd uitgevoerd worden.