Multiparametric cell-based sensor system for the detection of toxic pollutants in air

Abstract

Air pollution is a major threat facing mankind in the near future. Up to now, there is a lack of air monitoring systems, which are able to detect the toxicity of air. Classical toxicological experiments for the classification of air quality have been performed using living animals. This raises ethical concerns and should be avoided in the future. In vitro cell exposure device eliminate the controversy associated with experiments for the assessment of air toxicity and are therefore preferred. One of the major drawbacks of such existing systems is their low temporal resolution, as these devices take a long time to acquire information about the air pollution. In this work a novel cell-based gas biosensor is designed, constructed, and validated. It is based on the cell-sensor technology of the Bionas® 2500 Analyzing System. Here, living mammalian cells of the respiratory tract (hamster lung cells (V79), human lung cells (A549) and human nasal cells (RPMI 2650)) are cultured on a multi-electrode silicon chip. These cells are applied as sensitive layers because they represent the first targets of the mammalian respiratory tract and are therefore expected to show a higher robustness against gas exposure. The response of the cells to the exposure of airborne toxic substances is monitored by recording changes in the impedance, oxygen consumption, as well as acidification properties of the cells. Measures of different types of chromium ions dissolved in a water-based nutrient medium are presented to show the working principle and the high sensitivity of the sensor system for water applications. For gas monitoring experiments, three model gases which cover a broad range of gas properties were chosen for testing and evaluating the device for air monitoring applications. Carbon monoxide (CO) represents the class of highly water insoluble gases (such as nitrogen dioxide (NO2) and ozone (O3)). In contrast, ammonia (NH3) is a representative of highly soluble gases (such as hydrogen chloride (HCl) and formaldehyde (HCHO)). Acetone (C3H6O) is a member of volatile organic compounds (VOCs), which can be present, e.g., in indoor environments. The setup is designed so that the test gas is in direct contact with the cell surface as this is the only way to detect gases, which are insoluble in water-based liquid nutrient mediums. The medium covers the cells during normal operation, but can be quickly and carefully removed by a peristaltic pump. The quality of this draining method is investigated with infrared measurements as this spectroscopic technique is highly sensitive to water. A plug-on device for the sensor chip was manufactured enabling the gas flow to reach the cells and also reduce the shear forces on the cell-sensor interface, which could have the negative result of displacing or removing the cells from the chip. The maximum exposure time varies between 10 and 20 min, depending on the gas flow and the humidity. The relative humidity values for the control measurements with clean synthetic air (N2:O2 / 80:20) are adjusted to 60% – 80% to reduce the drying process during the gas exposure. Gas flow rates of 300 – 1000 ml/min are evaluated, which are rather high compared to other cell exposure systems using membranes to enable a simultaneous gas exposure and nutrient supply. To increase the stability of the cellular adhesion, the sensor chips are coated with extracellular matrix proteins, which were individually chosen for each cell type. Carbon monoxide induces a remarkable reduction in the respiration rate of all three tested cell lines, leading to a concentration-dependent sensitivity of this sensor setup. Neither the impedance nor the acidification was significantly affected by the toxic gas. Ammonia proved to reduce acidification and respiration rates and can be monitored in lower concentrations than in the liquid state. Acetone increased the physiological parameters slightly, however the effects are reversible. The toxicity of the watersoluble gases ammonia and acetone were compared with common cytotoxicity assays. Sequential measurements were performed to demonstrate the stability of the system following multiple gas exposure events, which would occur during an air monitoring study over several hours. The exposure to synthetic air had no effects on the upcoming gas exposure events, neither exposure to synthetic air nor acetone gas. Within 50 min, the cells were able to fully recover from a 10 min exposure to humidified synthetic air and reach the parameter levels prior to the exposure. Subsequent exposure to synthetic air has no influence on the course of previous acetone gas exposure measurements. The developed gas biosensor is not only applicable for single substances but also for mixtures of airborne pollutants. Puffed and inhaled cigarette smokes were tested as examples for complex mixtures of different gases, aerosols, and particles. The system presented here enables the development of future air monitoring applications as well as respiration drug studies or nanoparticle toxicological studies.

Luchtverontreiniging is een belangrijke bedreiging voor de volksgezondheid en dat zal wellicht ook in de toekomst zo blijven. Tot heden bestaat er een duidelijk tekort aan analysesystemen die in staat zijn de toxische invloeden van de omgevingslucht in kaart te brengen. Klassieke toxicologische experimenten voor de beoordeling van de luchtkwaliteit doen dan ook een beroep op levende proefdieren. Uiteraard roept dit ethische bezwaren op en daarom is het wenselijk dierproeven zoveel mogelijk te beperken. Een alternatieve aanpak voor de evaluatie van toxische stoffen in de lucht bestaat daarom uit de blootstelling van levende celculturen aan luchtstalen om mogelijke toxische invloeden onder in vitro condities te bestuderen. Een nadeel van de bestaande in vitro systemen is echter hun lage resolutie in het tijdsdomein omdat het betrekkelijk lang duurt alvorens toxische effecten door luchtverontreiniging zich op een meetbare manier manifesteren. In het kader van dit proefschrift werd een nieuwe, cel gebaseerde biosensor voor gassen ontworpen, geïmplementeerd en gevalideerd. Het onderliggende concept berust op de cel-gebaseerde sensortechnologie van het meetplatform Bionas® 2500 Analyzing System. Hierbij werden levende cellen uit het ademhalingsstelsel van zoogdieren (longcellen van hamsters (V79), humane longcellen (A549) en humane cellen uit het neusslijmvlies (RPMI 2650)) in cultuur gebracht op silicium chips voorzien van diverse meetelektrodes. Deze cellen zijn representatief voor het ademhalingsstelsel en tevens de eerste doelwitten voor toxische stoffen die met de ademlucht worden opgenomen. Omdat deze cellen ook in gewone fysiologische omstandigheden periodiek met gassen in contact staan worden ze als bijzonder robuust beschouwd betreffende hun blootstelling aan gasmengelingen en dienen ze daarom als sensitieve sensor-laag. De reactie van deze cellen op toxische stoffen in de lucht werd gevolgd aan de hand van veranderingen in i) de impedantie, ii) van het zuurstofverbruik van de cellen en iii) van de zuurtegraad in de extracellulaire omgeving. In een eerste stap werd de doeltreffendheid van deze meettechniek voor het opvolgen van de vitale parameters van de cellen aangetoond door een reeks referentiemetingen in cultuurmedia aan die bepaalde concentraties van chroomionen waren toegevoegd. Hiermee kon alvast de hoge gevoeligheid van het gehele sensorconcept worden aangetoond waarbij detectielimieten werden behaald die overeenkomen met de Europese aanbevelingen voor de zuiverheid van drinkwater. Voor de experimenten met blootstelling aan gassen werden drie verschillende gassoorten gekozen met zeer uiteenlopende fysische eigenschappen: Koolstofmonoxide (CO) behoort tot de categorie van de niet in water oplosbare gassen zoals ook stikstofdioxide (NO2) en ozon (O3). In tegenstelling hiertoe lost ammoniak (NH3) gemakkelijk op in waterige middens wat onder andere ook geldt voor waterstofchloride (HCl) en formaldehyde (HCHO). Aceton (C3H6O) tenslotte is een typevoorbeeld van de ‘volatile organic compound’ (VOCs) waarvan verhoogde concentraties worden aangetroffen in gesloten ruimtes. De meetopstelling werd zodanig ontworpen dat er een rechtstreeks contact ontstaat tussen de testgassen en het oppervlak van de cellen. Dit is immers de enige manier om cellen aan gassen bloot te stellen die onoplosbaar zijn in het waterige cultuurmedium. Het medium dat de cellen in normale omstandigheden volledig bedekt wordt hierbij door een peristaltische pomp kortstondig en met de nodige voorzicht afgezogen. De doeltreffendheid van deze drainagemethode werd bevestigd door zeer gevoelige infraroodspectroscopie. Voorts werd een speciaal opzetstuk voor de sensorchip ontwikkeld dat toelaat de cellen zodanig met de gasstroom in contact te brengen dat er geen mechanische schuifspanningen ontstaan door die de cellen van het chipoppervlak zouden lossen. De maximale blootstellingstijden lagen tussen de 10 en de 20 minuten, afhankelijk van het gasdebiet en de relatieve luchtvochtigheid. De relatieve vochtigheid voor referentiemetingen met zuivere synthetische lucht (N2:O2 / 80:20) werd ingesteld op 60% – 80% om het uitdrogen van de cellen tijdens hun contact met gas te minimaliseren. Er werd gewerkt met gasdebieten van 300 – 1000 ml/min en dit zijn redelijk hoge waarden vergeleken met membraan-gebaseerde blootstellingssystemen bij die de cellen continu in aanraking met het cultuurmedium blijven. Om de stabiliteit van de celadhesie te waarborgen werden de sensorchips voorzien van een deklaag van extracellulaire matrixproteïnen die individueel werden gekozen naargelang het specifieke celtype. Koolstofmonoxide leidde bei alle drie onderzochte cellijnen tot een opvallende daling van de cellulaire ademhaling waarbij ook de concentratieafhankelijkheid van de sensor-response werd bepaald. In tegenstelling hiertoe heeft koolstofmonoxide weinig significante invloed op het impedantiesignaal of de verzuringssnelheid. Blootstelling aan ammoniak echter vermindert zowel het zuurstofverbruik van de cellen als de acidificatie en in de gasfase konden zelfs lagere ammoniak concentraties worden opgespoord dan in opgeloste toestand in waterige middens. Aceton tenslotte resulteert in een lichte, reversibele verhoging van de vitale parameters van de celculturen. De toxiciteit van de wateroplosbare gassen ammoniak en aceton werd tevens aangetoond met cytotoxische standaardtesten. Voorts werden sequentiële meetreeksen uitgevoerd om de stabiliteit van het sensorsysteem te verifiëren bij meervoudige blootstellingsexperimenten die verschillende uren in beslag kunnen nemen. Het kan worden gesteld dat voorafgaande blootstelling van de cellen aan synthetische lucht geen nadelige invloed heeft op de betrouwbaarheid van navolgende metingen met bv. aceton. Na een blootstelling van 10 minuten aan synthetische lucht dient echter een recuperatiefase van 50 minuten in acht te worden genomen zodanig dat de vitale parameters van de cellen weer volledig kunnen herstellen. De ontwikkelde gas-biosensor kan tenslotte ook worden toegepast op complexe mengelingen van schadelijke stoffen in de lucht. Als modelsysteem voor een dergelijke mengeling van gassen, aerosols en fijne deeltjes werd tabaksrook onderzocht zowel in de gewone- als in de geïnhaleerde versie. Het sensorsysteem kan inderdaad tussen beide varianten differentiëren. In het kader van dit onderzoek werd dus een belangrijke stap gezet in de ontwikkeling van nieuwe, cel-gebaseerde meetsystemen voor het bewaken van de luchtkwaliteit, voor preklinische tests op inhaleerbare geneesmiddelen en voor toxicologische studies op nanodeeltjes.