Implementing flatworms in toxicology: the value of stem cell - oriented plasticity

Abstract

Prior to an effective and safe use of stem cells in therapeutic applications, it is essential to fully understand the mechanisms of stem cell proliferation. The microenvironment of stem cells is a controlling factor in this process, which implicates a high need for in vivo research. Flatworms are acknowledged for their excellent regenerative ability and their in vivo accessible stem cells. When chemically manipulated, pressure on stem cell is raised and information on the basic biology of these cells is ascertained. By implementing flatworms as a model organism in toxicology, novel insights are generated, useful in the field of (applied) toxicology and pharmacology as well as in the field of stem cell biology. In this work, we established flatworms as a toxicological model organism. We assessed the suitability of stem cell activity as a (predictive) parameter in this field and studied mechanisms underlying to this response. Because cadmium is known to have a biphasic effect on cell proliferation, this element serves as a capable chemical stressor. We worked with two commonly used flatworms as model organisms, Macrostomum lignano and Schmidtea mediterranea. Each model has its specific advantages. Macrostomum lignano is an organism that is ideally suited for morphological studies, whereas Schmidtea mediterranea is favoured for techniques that desire large amounts of tissue. In Macrostomum lignano, a high short-term exposure to cadmium decreased stem cell activity. Remarkably, although the epithelial tissue was damaged at the ultrastructural level, stem cells hardly showed structural defects. We found that heat shock proteins were present in regions with abundant active stem cells. Via RNAi the role of heat shock proteins (HSPs) was elucidated in a normal and cadmium induced stress situation. This revealed hsp60 and especially hsp90, as crucial elements in maintaining normal stem cell division. A continuous upregulation of hsp70 compensated for the absence of the other hsps, which emphasises the basic need for these proteins. During severe stress hsp90 knockdown led to an overall down regulation of apoptotic, anti-oxidative, cell division and stem cell genes. The flatworm Schmidtea mediterranea was used in a long-term experimental set-up in which low cadmium concentrations induced an increased stem cell proliferation. During the exposure we did not observe structural damage to stem cells or surrounding tissues. The enzymatic activity of anti-oxidative enzymes of catalase, gluthatione-S-transferase and superoxide dismutase and the transcript levels of genes such as hsps, mapkp38 and p53 were triggered as a response to cadmium. However, these effects were transient. In order to unravel the genes responsible for the increased cell proliferation we combined cadmium exposure with the knockdown of selected genes. We identified both hsp70 and the apoptotic gene bcl2 as specific underlying mechanisms of the stress-induced hyperproliferation or survival during cadmium stress. In summary, this work shows that both flatworms are successful toxicological model organisms and the implementation of in vivo flatworm’s stem cells are of added value in toxicological research. A high concentration of cadmium during a short-term exposure leads to a hypoproliferation whereas low-level long-term exposure leads to hyperproliferation. In both outcomes HSPs were prime responses to cadmium stress as well as important in normal stem cell maintenance. In addition, we created a model in which we can categorize genes regarding to their importance in hyperproliferation, related to a specific stress factor.

Voorafgaand aan het therapeutisch gebruik van stamcellen is een goed begrip over wanneer en hoe stamcellen delen noodzakelijk. Aangezien de micro-omgeving van stamcellen een controlerende factor is in deze processen, is onderzoek van stamcellen in hun natuurlijke omgeving essentieel. Platwormen staan bekend voor hun excellent regeneratie vermogen met gemakkelijk in vivo te bestuderen stamcellen. Met behulp van chemische manipulatie kunnen stamcellen onder stress gebracht worden, waarna hun proliferatiecapaciteit aangetast kan worden en effecten op proliferatiecapaciteit kunnen bestudeerd worden. In deze studie bestudeerden we het nut van platwormen als model organisme in toxicologisch onderzoek. Naast het beoordelen van de stamcelactiviteit werden de onderliggende mechanismen bestudeerd. Cadmium heeft een dubbelzijdig effect op celproliferatie en is daarvoor geschikt als chemische manipulator. We werkten met twee frequent gebruikte modelorganismen, Macrostomum lignano en Schmidtea mediterranea. Elk organisme heeft zijn specifieke voordelen als model, zo is bijvoorbeeld Macrostomum lignano uitermate geschikt voor morfologische studies en leent Schmidtea mediterranea zich beter voor technieken die grote hoeveelheden weefsel vragen. Een hoge en korte termijn bloostelling aan cadmium leidden in Macrostomum lignano tot een vermindering in stamcelactiviteit. We konden vaststellen dat de heat shock respons niet enkel belangrijk was in stress situaties maar dat deze ook een rol heeft in stamcelactieve gebieden. Na blootstelling aan cadmium werd er ernstige ultrastructurele beschadiging aan het epidermale weefsel geobserveerd, terwijl de stamcellen structureel weinig aangetast waren. Vervolgens hebben we aan de hand van RNA interference (RNAi) de rol van heat shock proteinen (HSPs) onderzocht tijdens normale en door cadmium geïnduceerde stress situaties. Hieruit blijkt dat heat shock protein (hsp60) en voornamelijk heat shock protein 90 (hsp90) cruciaal zijn voor stamceldeling. De nood aan HSPs werd nog meer duidelijk wanneer na het reduceren van hsp60 en hsp90, heat shock protein 70 (hsp70) sterk verhoogd tot expressie kwam. Hsp70 zal op deze manier als vervanging voor de andere HSPs kunnen optreden. Onder zware stress leidde een verminderd hsp90 gehalte tot een algemene reductie in de transcriptie van ondermeer apoptotische, antioxidatieve, celdelings- en stamcelgenen. In een tweede toonden we bij de platworm Schmidtea mediterranea aan dat cadmium een verhoogde stamcelactiviteit uitlokt na een langdurige bloostelling. Tijdens deze bloostelling konden we geen ultrastructurele schade aan stamcellen noch aan het omliggende weefsel vaststellen. De enzymatische activiteit van de antioxidatieve enzymen catalase, gluthation-S-tranferase en superoxide dismutase en de activiteit van genen zoals hsp70, mapkp38 en p53 was verstoord, al bleek deze omkeerbaar. Om de cruciale genen in de cadmiumgeïnduceerde proliferatiecapaciteit te achterhalen werd een combinatie gebruikt van RNAi en cadmiumblootstelling. Op deze manier kon worden vastgesteld dat hsp70 een cruciale rol heeft in de verhoogde stamcel proliferatie en het apoptotische gen bcl2 belangrijk is in de overleving na cadmium blootstelling. Aan de hand van dit experiment konden we tijdens blootstelling stressspecifieke genen onderscheiden van stamcelspecifieke genen. Deze studie toonde aan dat platwormen geschikte modelorganismen zijn in toxicologisch onderzoek. Het gebruik van stamcellen is een toegevoegde waarde aangezien deze in vivo bestudeerd kunnen worden onder stress. Een hoge concentratie cadmium op korte termijn leidde tot een daling in proliferatiecapaciteit, een lage concentratie op langere termijn leidde tot een verhoging in proliferatiecapaciteit. In beide situaties bleek HSPs een fundamentele respons tijdens cadmium stress alsook hadden ze een rol in stamceldynamiek