QCM-based biomimetic sensors for the detection of nicotine, histamine, and malachite green in body fluids and environmental samples.

Abstract

The need for fast monitoring of compounds is increasing in medicine, food safety and environmental safety. This can be accomplished with the use of sensors which are highly sensitive and selective. Biosensors can fulfill these requirements with an array of different natural recognition elements such as DNA, antibodies, enzymes, cells, etc. The biggest concerns about these sensors are the cost, shelf life and their inability to be used in extreme pH or temperature environments. Synthetic recognition elements can achieve the criteria of the biosensors. However, without their major drawbacks. Molecular imprinted polymers (MIP) are a great candidate as a recognition element. Sensors that use synthetic recognition element are called biomimetic sensors. In this work, biomimetic sensors are created that use MIPs for recognition of histamine, malachite green and L-nicotine. The principle of a MIP is the creation of a mold around a target molecule. After removal of this target, the mold can only rebind that target. To achieve this, a target molecule is mixed together with functional monomers (e.g. methacrylic acid) and crosslinking monomers (e.g. ethylene glycol dimethacrylate) in a fluid. The functional monomers will form connections with the target molecules. The cross linking monomers are then polymerized so the functional monomers are held into place in an established position. This bulk polymer is crushed and sieved in order to obtain small micro particles. When the target molecule is extracted from these particles, a custom made synthetic recognition element is achieved which can rebind its target molecule. For reasons of control, a non imprinted polymer (NIP) is created in the same way save the use of the target molecules thus creating a NIP which only will bind in a non specific way. The effectiveness of the created MIP is first tested using (Ultraviolet/Visible) UV/Vis spectroscopy. MIPs are mixed with a solution containing a known concentration of the target molecule. The MIPs will bind a certain amount of Once the MIPs is optimized for their target molecules, they are implemented into a sensor setup. In this work, impedance spectroscopy and gravimetric detection via a quartz crystal microbalance are used. Implementation of the MIPs occurs via immobilization on a polymer layer which was applied on the electrode surface. The polymer used is dependent on the read out technique. With impedance spectroscopy the conjugated polymer OC1C10-PPV is used while the Quartz crystals used for gravimetric detection are coated with PVC (polyvinyl chloride). Impedance spectroscopy is a very sensitive technique that measures changes in impedance (electrical resistance) in a frequency spectrum over time. Measurements are performed in the lower frequency ranges as binding of the target molecules to the MIP induces capacitive changes in the recognition layer. It is possible to measure up to 4 different channels, which allows for differential measurements. Histamine measurements were performed in PBS (phosphate buffered saline) in the nanomolar range. Upon binding of histamine to the MIP, the impedance increased significantly while the NIP showed no change. Histidine also showed no impedance change, proving that the MIP is very selective towards histamine. After these successful measurements in PBS, tune brine was spiked with histamine and measured in PBS. Despite the complex fluid, the MIP was able to selectively bind histamine while the NIP showed no significant response. Malachite green was also successfully detected in the nanomolar range while the NIP showed a lower response. Gravimetric detection uses a quartz crystal that vibrates at a certain predetermined frequency, the resonance frequency. When the target molecule binds to the MIP, the resonance frequency will decrease linearly with the added mass. This sensor setup is used to measure histamine in deionized water in the micromolar range. The MIP was able to bind 4 times the amount of histamine than the NIP. Malachite green was also successfully tested with QCM in the nanomolar range, which is low for the QCM read out technique. These measurements were performed in water with a pH value of pH 3. L-nicotine was measured with QCM-D (quartz crystal microbalance – dissipation). Dissipation is the amount of energy the crystal dissipates after a crystal excitation. The dissipation will change when softer material is bound to the crystal surface. Measurements were performed in deionized water and in PBS. The amount of L-nicotine that can be bound in deionized water is greater than in PBS. This is due to the ions present in the PBS as they inhibit the interactions between L-nicotine and the MIP. Lower concentrations of PBS showed an increase in the binding potential of the MIP towards L-nicotine. When measured in PBS, the optimal pH value was pH 9. The dissipation changes of the MIP upon binding of L-nicotine were also significantly higher than the NIP in deionized water and PBS. The L-nicotine MIP was also tested with spiked urine and saliva. These test showed that the MIP was able to bind L-nicotine despite being in a complex matrix. As a final test, the saliva of a subject who chewed nicotine gum (4 and 2 mg Lnicotine) and chewing tobacco was collected and measured with the QCM-D. The MIP was able to differentiate between the 4 mg and 2 mg saliva sample. The MIP was also successful in binding the L-nicotine from the chewing tobacco samples. This work has proven that molecular imprinted polymers are promising candidates for future sensor applications. The MIP was able to function in various complex matrices without losing its sensitivity. Further investigation could implement the MIPs in other more sensitive read out techniques that allow for easier miniaturization, creating a hand held diagnostic tool for the future.

De nood om snel stoffen te kunnen detecteren is snel aan het groeien in de zowel de medische wereld, voedsel veiligheid als in de natuur. Dit kan bewerkstelligd worden met de hulp van sensoren die gevoelig en selectief zijn. Biosensoren voldoen aan deze eisen met behulp van verschillende natuurlijke herkenningselementen zoals, DNA, antilichamen, enzymen, cellen etc. Het grootste nadeel van deze natuurlijke herkenningselementen zijn de kostprijs, duurzaamheid en hun gebruikslimiet. Deze kunnen namelijk niet gebruikt worden in omgevingen met een hoge of lage pH waarde of met een hoge of lage temperatuur. Synthetische herkenningselementen kunnen wedijveren met de natuurlijke herkenningselementen maar zonder de grote nadelen. Molecular imprinted polymers (MIPs) zijn een sterke kandidaat als synthetisch herkenningselement. Sensoren die gebruik maken van synthetische herkenningselementen worden biomimetische sensoren genoemd. In dit werk zijn biomimetische sensoren gecreëerd die gebruik maken van MIP voor de herkenning van moleculen zoals histamine, malachiet groen en L-nicotine. Een MIP wordt gemaakt door rond een doelmolecule (bv L-nicotine) een unieke pasvorm te creëren. Na het verwijderen van de doelmolecule zal de pasvorm enkel nog de doelmolecule opnieuw kunnen binden. Om de MIP te maken wordt de doelmolecule vermengd met functionele monomeren (MAA) en crosslinker monomeren (EGDM) in een vloeistof. De functionele monomeren zullen verbindingen vormen met de doelmolecule. De monomeren worden vervolgens gepolymeriseerd en zo worden de functionele monoren vastgezet in een welbepaalde positie. Dit polymeer wordt dan verbrijzeld en gezeefd om kleine micro deeltjes te krijgen. Wanneer de doelmolecule verwijderd wordt, verkrijgen we een synthetisch herkenningselement dat de doelmolecule kan herbinden. Om een controle te hebben, wordt een non imprinted polymer (NIP) gecreëerd die op dezelfde wijze wordt gemaakt maar zonder de aanwezigheid van de doelmolecule. Deze NIP kan de doelmolecule alleen op niet specifieke wijze binden omdat de unieke pasvorm hier niet aanwezig is. De goedheid van de MIP wordt eerste getest met behulp van Ultraviolet/Visible (UV/Vis) spectroscopie. De MIP wordt vermengd met een vloeistof die een gekende concentratie van de doelmolecule bevat. De MIP zal een deel van de doelmolecule binden. De MIPs, en dus ook de gebonden doelmolecules, worden verwijderd uit de vloeistof. De overgebleven doelmoleculen in de vloeistof worden gemeten met UV/Vis spectroscopie. Dit resultaat wordt dan vergeleken met een op voorhand opgemeten basislijn waardoor de gebonden concentratie van de doelmolecule bepaald kan worden. UV/Vis spectroscopie is een goede eerste test om de karakteristieken van de MIP en NIP te achterhalen. UV/Vis spectroscopie kan wel alleen gebruikt worden bij hoge concentraties (milimolaire bereik). Andere sterk gelijkende moleculen worden ook getest op de MIP en NIP. Histidine wordt gebruikt om de selectiviteit van de histamine MIP te testen en cotinine voor de L-nicotine MIP testen. Eenmaal de MIP geoptimaliseerd is voor de doelmolecule, worden ze in de sensor geplaatst. In dit werk wordt gebruik gemaakt van impedantie spectroscopie en gravimetrische detectie via een kwarts kristal microbalans. De MIPs worden geïmmobiliseerd op een polymeer laag die op de elektrodes aangebracht wordt. De gebruikte polymeer laag is afhankelijk van de gebruikte sensor techniek. Bij impedantie spectroscopie wordt er gebruik gemaakt van het geconjugeerd polymeer OC1C10-PPV terwijl bij de gravimetrische detectie de kwarts kristallen worden bedekt met PVC. Impedantie spectroscopie is een zeer gevoelige techniek die veranderingen in de impedantie (elektrische weerstand) meet over een breed frequentie spectrum. De metingen worden uitgevoerd in het lage frequentie bereik want als de doelmolecule bindt met de MIP zullen er capacitieve veranderingen gebeuren aan de herkenningslaag. Met de sensor is het mogelijk om tot 4 verschillende plaatsen te meten. Dit laat toe om op een differentiële manier te meten. Histamine metingen werden uitgevoerd in PBS (phosphate saline buffered) in het nanomolaire bereik. Als de MIP histamine bindt gebeurde er een impedantie stijging die niet werd waargenomen voor de NIP. Histidine toevoegingen toonde noch voor de MIP noch voor NIP veranderingen in de impedantie. Dit bewijst dat de MIP selectief is voor histamine. Na deze succesvolle metingen werd tonijnsap aangevuld met histamine. Ondanks de complexe vloeistof waarin gemeten werd, kan de MIP probleemloos histamine binden terwijl de NIP geen respons toonde. Malachiet groen werd ook succesvol impedimetrisch opgemeten in het nanomolaire bereik. Gravimetrische detectie maakt gebruik van een kwarts kristal dat op een welbepaalde frequentie zal trillen, de resonantie frequentie. Wanneer de doelmolecule bindt met de MIP, zal de resonantie frequentie lineair dalen door het toegevoegde gewicht op het kwarts kristal. De sensor opstelling werd gebruikt om histamine te meten in gedeïoniseerd water in het micromolaire bereik. De MIP kon meer de 4 maal zoveel histamine binden dan de NIP. Malachiet groen werd ook succesvol gemeten maar wel in het nanomolair bereik wat zeer laag is voor een kwarts kristal microbalans. Deze metingen gebeurden in water met een pH 3. L-nicotine metingen werden uitgevoerd met behulp van een kwarts kristal microbalans met de mogelijkheid om de dissipatie te meten. Dissipatie is een indicatie hoe lang een kristal zal natrillen nadat het niet meer wordt aangedreven. De dissipatie zal sterker veranderen als er zachtere materialen gebonden worden op het kristal. Metingen werden uitgevoerd in zowel PBS als in gedeïoniseerd water. De hoeveelheid L-nicotine die door de MIP gebonden kan worden in gedeïoniseerd water is groter dan in PBS. Dit is door de aanwezigheid van ionen die de binding bemoeilijken. PBS met een lagere concentraties vertoonden dan ook een grote bindingscapaciteit. Wanneer er in PBS gemeten werd, bleek de optimale pH 9 te zijn. De dissipatie veranderingen die bij binding van L-nicotine aan de MIP gebeurden, bleken ook significant groten te zijn in gedeïoniseerd water dan in PBS. De Lnicotine MIP werd ook getest met urine en speeksel dat aangevuld was met L-nicotine. Deze testen toonden aan dat de MIP geen enkel probleem hadden om L-nicotine te binden ondanks dat zij zich in een complexe vloeistof bevonden. Als een laatste test werd het speeksel van een vrijwilliger die nicotine kauwgom (4mg en 2 mg L-nicotine) and pruimtabak geconsumeerd had, opgevangen en opgemeten. De MIP kon differentiëren tussen de 4mg en 2mg L-nicotine speeksel concentraties. De MIP was ook succesvol in het binden van de L-nicotine die zich in de pruimtabak stalen bevond. Dit werk heeft bewezen dat MIPs een sterke kandidaat zijn voor toekomstige sensor toepassingen. De MIP kon functioneren in verschillende complexe vloeistoffen zonder verlies van de gevoeligheid. Verder onderzoek zou deze MIP kunnen integreren in andere meer gevoeligere sensors die ook geminiaturiseerd kunnen worden waardoor een draagbaar diagnostische apparaat voor de toekomst mee kan gebouwd worden.