Effects of cadmium on the proteome of roots and leaves of poplar: comparison between hydroponically and soil grown plants

Abstract

Atmospheric deposits originating from zinc smelters resulted in large scale diffuse metal contamination in North Eastern Belgium. Since toxic metals, like cadmium (Cd), can pose severe risks to human health, threshold values have been defined for soils and crops. Exceeding these threshold values and consequently loosing these economic valuable soils, enhances the authorities’ interest in alternative remediation strategies. Classical remediation techniques (e.g. soil washing, excavation and dumping) are expensive, destructive for soil structure and microorganisms and not applicable for large scale and diffuse contaminations. Phytoextraction, the in situ use of plants to extract contaminants from contaminated soils, is believed to be a promising alternative for metal contaminated sites. However, to be economically attractive the phytoextraction process needs to be improved. In case of organic contaminants, equipping plant endophytes with appropriate degradation pathways, resulted in a decrease of phytotoxicity and evapotranspiration and, by consequence, an enhanced remediation efficiency. This raised the question if equipping plant endophytes with metal sequestration systems might improve efficiency of metal phytoextraction as well. In section 3, two plant growth-promoting bacteria were equipped with the CZR operon, which enables bacteria to bind Cd onto their cell wall. Based on phenotypical traits, transconjugant strain W1366-5 seemed most promising to enhance phytoextraction of Cd contaminated soils. However, the results from the greenhouse experiment suggested that transconjugant strain E1600-11 is more promising in planta under Cd-exposed conditions (chapter 3.1). Since obvious differences in plants’ toxicity responses to Cd were observed in hydroponical and soil cultivation systems, a more in depth examination of the underlying mechanisms of Cd toxicity was conducted using a proteomic approach. Therefore, first an optimization of the proteomics workflow was performed (chapter 4.1). Subsequently, a literature study was conducted to get more insights into the already described effects of Cd on the plants’ proteome; from this study, it became obvious that a comparison between proteomics experiments is not that straightforward. Therefore, encountered obstacles were discussed in a meta-analysis (chapter 4.2). Further, a comparison was made between hydroponic and soil cultivation systems indicating that differences in Cd responses between both cultivation systems might exist. However, since a huge diversity in experimental set ups and used materials was present, this hypothesis cannot be confirmed or rejected based on the meta-analysis data. In order to address the question whether an extrapolation from hydroponically obtained data towards soil grown plants is possible, an experiment was conducted in which poplar cuttings were grown on both, hydroponic (chapter 4.3) and soil (chapter 4.4) cultivation systems. Except for the cultivation system, other parameters were kept identical in these experiments. Their response to Cd was examined by comparing control cuttings to Cd-exposed cuttings after 3 and 21 days of exposure. Comparing the proteomic data from our hydroponics experiment (chapter 4.3) to those extracted from hydroponic cultivation experiments in the meta-analysis, revealed a general down-regulation of CO2-fixation, chloroplast electron transport and ATP synthases in leaves. However, contrasting responses were present for the stress metabolism. In roots, the same metabolic pathways were affected in our experiment compared to those present in the meta-analysis, though a closer look revealed some differences. The general down-regulation of CO2-fixation, chloroplast electron transport and ATP synthases present in soil grown leaves when studying the meta-analysis data, was not confirmed in our soil grown experiment (chapter 4.4). As for the hydroponic cultivation experiment, the same metabolic pathways were addressed in soil grown roots of our experiment compared to those described in the meta-analysis. However, a closer look again revealed some dissimilarities. A comparison between both experiments (chapter 4.5) revealed dissimilarities in the plants’ response to Cd. Moreover, it was observed that an effect time was minor in hydroponically grown leaves compared to soil grown leaves. In conclusion, our results confirm that plant responses present in hydroponic cultivation systems cannot be extrapolated straightforward towards soil grown plants. Therefore it is recommendable to include soil cultivation systems in studies with prospects to future field application. Since – to our knowledge – until now no study has been conducted comparing the effects of hydroponic and soil cultivation system, this work offers novel insights in the effects of cultivation systems on plants proteomic response to metal stress.

Atmosferische depositie afkomstig van zink fabrieken resulteerde in een grootschalige diffuse metaal vervuiling in NO België. Vermits toxische metalen zoals Cd, ernstige risico’s kunnen vormen voor de menselijke gezondheid, werden er drempelwaarden opgelegd voor landbouwgrond en gewassen. Deze drempelwaarden worden echter vaak overschreden waardoor economisch waardevolle gronden verloren gaan. Hierdoor is de interesse van de overheid voor alternatieve remediatie technieken gestegen. Klassieke remediatie technieken zijn duur, tasten de bodemstructuur en micro-organismen aan en zijn niet toepasbaar voor grootschalige diffuse verontreinigingen. Fytoextractie, het in situ gebruik van planten om contaminanten te extraheren uit de vervuilde bodems, wordt gezien als een veelbelovend alternatief voor de zuivering van metaal gecontamineerde bodems. Om economisch aantrekkenlijk te zijn, moet de efficiëntie van dit proces echter verhoogd worden. Het uitrusten van plant endofyten met geschikte afbraakroutes, resulteerde in een verlaagde toxiciteit en evapotranspiratie van organische contaminanten. Dit succes wierp de vraag op of het uitrusten van plant endofyten met metaal sequestratie mechanismen een soorgelijk resultaat zou opleveren in metaal verontreinigde bodems. In deel 3 werden 2 plantengroei bevorderende bacteriën uitgerust met het CZR operon, hetgeen ervoor zorgt dat bacteriën metalen kunnen binden op hun celwand. Gebaseerd op de onderzochte fenotypische eigenschappen leek de transconjugante stam W1366-5 het meest belovend. De resultaten van het serre experiment toonden echter aan dat transconjugante stam E1600-11 betere perspectieven biedt in planta wanneer deze blootgesteld zijn aan Cd (hoofdstuk 3.1). Waargenomen verschillen in de effecten van Cd op de plant tussen hydro- en grondculturen leidden ertoe een gedetailleerde studie te verrichten naar de onderliggende mechanismen van Cd toxiciteit, gebruik makend van een proteomics benadering. Hiervoor werd de proteomics workflow eerst geoptimaliseerd (hoofdstuk 4.1). Vervolgens werd een literatuurstudie uitgevoerd om een beter overzicht te krijgen van de reeds gekende effecten van Cd op het proteoom van de plant; hierbij werd het duidelijk dat een vergelijking tussen proteoom studies niet zo eenvoudig is. De vastgestelde obstakels worden besproken in een meta-analyse (hoofdstuk 4.2). Hierin werd bovendien ook een vergelijking gemaakt tussen hydro- en grondcultuur experimenten wat duidelijk maakte dat planten verschillend lijken te reageren op Cd, afhankelijk van de gebruikte cultuurmethode. De grote diversiteit aan groeiprotocols laat echter niet toe om deze hypothese hard te maken. Om uit te maken of extrapolatie van hydrocultuur data naar grondcultuur experimenten mogelijk is, werd een experiment uitgevoerd waarin populier stekken gegroeid werden in hydrocultuur (hoofdstuk 4.3) en grondcultuur (hoofdstuk 4.4). Met uitzondering van het groeisysteem, werde andere parameters in beide experimenten gelijk gehouden. Het effect van Cd op populier werd onderzocht door de responsen van controle stekken te vergelijken met deze van Cd blootgestelde stekken na 3 en 21 dagen blootstelling. Het vergelijken van de proteoom data van het hydrocultuur experiment (hoofdstuk 4.3) met deze verkregen uit de meta-analyse van in hydrocultuur gegroeide plant, brengt een algemene neerregulatie van CO2-fixatie, chloroplast elektronen transport en ATP synthasen aan het licht in bladeren. Op het niveau van responsen van het stress metabolisme werden echter verschillen vastgesteld. In wortels werden in ons experiment dezelfde metabole pathways beïnvloed als diegene die naar voor kwamen uit de studie van de hydrocultuur data in de meta-analyse. Meer diepgaand onderzoek van de voorhanden zijnde gegevens bracht echter ook enkele verschillen aan het licht. In de meta-analyse werd voor bladeren van planten gegroeid op bodems een algemene neerregulatie van CO2-fixatie, chloroplast elektronen transport en ATP synthasen vastgesteld. Deze responsen werden echter niet bevestigd in onze studie (hoofdstuk 4.4). Net zoals voor de hydrocultuur studie werden in ons experiment weliswaar dezelfde metabole pathways beïnvloed als in de meta-analyse, maar werden bij een meer diepgaande studie van de resultaten ook verschillen gevonden. Een vergelijking tussen beide experimenten (hoofdstuk 4.5) bevestigde de vermoedens dat planten gegroeid op hydrocultuur en op grond verschillend lijken te reageren op Cd. Het tijdseffect was duidelijk lager in hydrocultuur gegroeide bladeren vergeleken met bladeren gegroeid in grond. Deze data bevestigen dan ook dat responsen vastgesteld bij in hydrocultuur gegroeide planten niet zomaar geëxtrapoleerd mogen worden als representatief voor planten gegroeid op bodems. Omdat er – voor zover wij weten – nog geen studies voorhanden zijn die de responsen van planten gegroeid in hydrocultuur en grond op Cd blootstelling vergelijken, levert dit werk nieuwe inzichten in de effecten van groeisystemen op de responsen van planten onder metaal stress.