Mechanisms of metal homeostasis and detoxification in metal sensitive and tolerant isolates of Suillus luteus, an ectomycorrhizal fungus

Abstract

By natural selection, the ectomycorrhizal fungus Suillus luteus could evolve metal tolerant ecotypes on contaminated sites. These metal tolerant ecotypes were previously shown to be very efficient in protecting their host plants, the pine trees, from metal toxicity. The molecular-genetic determinants underlying the tolerance traits in S. luteus and the associated plant protection mechanisms are unknown. Nevertheless, knowledge about these processes could be useful for bioremediation and biofortification purposes. In chapter 2 Cd detoxification mechanisms of Cd-sensitive and Cd-tolerant S. luteus isolates are explored by a transcriptomic approach. Only few genes showed an altered transcription level as a consequence of Cd treatment. Among them, genes encoding proteins involved in general stress response (e.g. heat shock protein), metabolism and energy supply (e.g. succinyl-CoAsynthetase) but none of them is directly linked to metal homeostasis (e.g. transporters, chelators). Based on gene expression pattern (constitutive or Cdinduced) we could not make a clear separation between the groups of Cd sensitive and Cd tolerant isolates. Variation in gene expression level was as large between isolates of the same sensitivity group as between isolates of contrasting sensitivity groups. This intraspecific variation on gene expression level might help the pioneer species S. luteus in adapting to novel or disturbed environments. In order to improve our understanding of metal homeostasis in S. luteus, we decided to study expression of genes of which the involvement in metal homeostasis was demonstrated in other organisms. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR) is currently the technique of choice for gene expression analysis of a set of chosen genes of interest. However, accuracy and reliability of qRT-PCR measurements strongly depends on normalization with appropriate endogenous reference genes. In chapter 3 we select, evaluate and validate a set of candidate reference genes for use in gene expression studies of different S. luteus isolates exposed to Cd and Zn. Each isolate requires a distinct set of reference genes, regardless of the metal treatment. Stability of the selected candidate reference genes was only little affected by metal treatment. When including different isolates in one analysis it is hard or nearly impossible to meet criteria currently used to determine stable reference genes. Therefore we propose new minimal requirements resulting in the use of a high number of validated reference genes to normalize gene expression data in species showing a high level of intraspecific variation. In chapter 4 we identify and characterize two CDF-family transporters of S. luteus. Both identified transporter, SlZnT1 and SlZnT2, are very similar in sequence and gene structure and are probably the result of a recent gene duplication. Comparative analysis of the deduced protein sequence predicts them to be Zn transporters. This could be confirmed by functional analysis in yeast, the fungal model system, for SlZnT1. Overexpression of SlZnT1 rescued the hypersensitive phenotype of the Δzrc1 yeast mutant and the encoded protein localized to tonoplast. SlZnT1 is expected to contribute to Zn storage and detoxification in S. luteus by transporting it into the vacuole. A labile Zn pool was detected in all S. luteus vacuoles. We were not able to express functional SlZnT2 in yeast. Despite the presence of Zn responsive elements in the promoter sequences of both transporter genes we could not detect differences in gene expression upon Zn exposure. Transcription of SlZnT1 and SlZnT2 genes seems to be constitutively in S. luteus. However, the Zn tolerant and Zn sensitive S. luteus isolate differ in SlZnT2 expression level. This difference in expression level might be (partly) caused by a difference in promoter sequence. A wide range of mechanisms including exclusion, chelation, compartmentalization, anti-oxidative response and repair mechanisms are known to be important for metal detoxification in other organisms. The importance of these mechanisms for Zn detoxification and adaptive tolerance in S. luteus is explored in chapter 5. Gene expression and enzyme activity profiles of key players in different detoxification pathways were examined in several Zn sensitive and Zn tolerant S. luteus isolates. Additionally, Zn, Fe and Mn content and TBARS were determined. In general, a high intraspecific variation was detected on all levels which might indicate that distinct isolates use differential strategies to cope with Zn stress. Selection for a high SlZnT2 expression occurred in Zn tolerant S. luteus isolates. This high expression might be caused by gene expansion. All Zn sensitive S. luteus isolates are estimated to have a single SlZnT2 gene copy whereas SlZnT2 copy number in Zn tolerant isolates varies from two to seven. SlZnT2 encodes a CDF family protein which is predicted to transport Zn and of which the cellular location is unclear. To unravel its contribution to Zn tolerance in S. luteus a further functional characterization of the gene is needed. Thorough functional genetics requires phenotypic analysis of overexpression, knock-down or knock-out mutants. To obtain mutants a transformation of the wild-type is needed. In chapter 6 we make an attempt to obtain an Agrobacterium mediated transformation protocol for use in S. luteus. Agrobacterium tumefaciens mediated transformation is a powerful technique to study gene function in fungi. However, success rate of the transformation is highly dependent on several factors. We were able to transform as well haploid monokaryotic as dikaryotic S. luteus mycelium. Nevertheless, all obtained mutants showed an aberrant morphology characterized by mitospore formation and melanin accumulation. Most likely this aberrant morphology is not directly linked to the mutation itself but rather caused by stress during co-culture period. Therefore a further optimization of the protocol is needed before use in functional gene studies. In conclusion, a high intraspecific variability in molecular-genetic response to Cd and Zn exposure was observed in S. luteus. This might indicate that there is at least at the molecular-genetic level, no general strategy to detoxify excess metals and that each isolate tends to have its own preferred mechanism to maintain metal homeostasis. However, all Zn tolerant isolates were selected for a high SlZnT2 gene expression partly caused by extensive gene multiplication and potentially supported by differences in cis-regulation. Function of the SlZnT2 gene is unknown and further characterization of the gene is required to unravel its role in adaptive Zn tolerance in S. luteus. Therefore since functional genetics is still in its infancy in ectomycorrhizal fungi, technical obstacles have to be tackled first.

Door natuurlijke selectie kon de ectomycorrhiza schimmel Suillus luteus metaaltolerante ecotypes ontwikkelen op gecontamineerde sites. Voor deze metaaltolerante ecotypes werd eerder aangetoond dat ze hun gastheerplanten, dennebomen, efficiënt beschermen tegen metaaltoxiciteit. De moleculairgenetische determinanten verantwoordelijk voor tolerantie in S. luteus en het geassociëerde plantprotectie mechanisme zijn onbekend. Nochtans kan kennis omtrent deze processen nuttig zijn voor bioremediatie en biofortificatie doeleinden. In hoofdstuk 2 worden de Cd-detoxificatiemechanismen van Cd-sensitieve en Cd-tolerante S. luteus isolaten onderzocht door middel van een transcriptoomanalyse. Slechts enkele genen toonden een verandering in transcriptieniveau ten gevolge van de Cd behandeling. Onder hen, genen coderend voor proteïnen betrokken in de algemene stress respons (bv. “heat shock protein”), metabolisme en energievoorziening (bv. succinyl-CoAsynthetase) maar geen enkel gen dat direct gelinkt kan worden aan metaalhomeostase (vb. transporters, chelatoren). Op basis van het genexpressie patroon (constitutief of Cd-geïnduceerd) konden we geen duidelijk onderscheid maken tussen de groep van Cd-sensitieve en Cd-tolerante isolaten. Variatie in genexpressie was even groot tussen isolaten van de zelfde groep als tussen isolaten van verschillende groepen. Deze intraspecifieke variatie op niveau van genexpressie zou de pioniersoort S. luteus kunnen helpen in het aanpassen aan verstoorde omgevingen. Om ons begrip van metaalhomeostase in S. luteus te verbeteren, besloten we de expressie van genen waarvan in andere organismen werd aangetoond dat ze een rol spelen in metaalhomeostase te bestuderen. Kwantitatieve “reverse” transcriptie PCR (qRT-PCR) is momenteel de aangewezen techniek om genexpressie van een set van geselecteerde genen te analyzeren. De juistheid en betrouwbaarheid van qRT-PCR metingen hangt echter sterk af van normalizatie ten opzichte van geschikte endogene referentiegenen. In hoofdstuk 3, selecteren, evalueren en valideren we een set van kandidaat referentiegenen voor gebruik in genexpressie studies in verschillende S. luteus isolaten blootgesteld aan Cd en Zn. Elk isolaat vereist een andere set van referentiegenen, ongeacht de metaalbehandeling. Stabiliteit van de geselecteerde kandidaat referentiegenen werd slechts weinig beïnvloed door metaalbehandeling. Wanneer verschillende isolaten meegenomen worden in dezelfde analyse is het moeilijk of bijna onmogelijk om te voldoen aan de criteria die momenteel gebruikt worden om stabiele referentiegenen te bepalen. Daarom stellen we nieuwe minimale vereisten voor, die resulteren in het gebruik van een groot aantal gevalideerde referentiegenen om genexpressie data te normaliseren in soorten met een grote intraspecifieke variatie. In hoofdstuk 4, identificeren en karakteriseren we twee CDF-familie transporters van S. luteus. Beide transporters, SlZnT1 en SlZnT2, zijn vergelijkbaar in sequentie en genstructuur en zijn allicht het resultaat van een recente genduplicatie. Vergelijkende analyses van de afgeleide proteinesequenties voorspellen dat het Zn transporters zijn. Dit kon bevestigd worden voor SlZnT1 door functionele analyse in gist, het modelsysteem voor schimmels. Overexpressie van SlZnT1 keert het hypersensitieve fenotype van de Δzrc1 mutant om. Het gecodeerde proteïne bevindt zich in de tonoplast. SlZnT1 draagt allicht bij aan Zn-opslag en –detoxificatie in S. luteus door het te transporteren naar de vacuole. Een voorraad labiel Zn kan gedetecteerd worden in de vacuoles van alle S. luteus isolaten. We waren niet in staat functioneel SlZnT2 tot expressie te brengen in gist. Ondanks de aanwezigheid van Znresponsieve elementen in de promotersequenties van beide transporters konden we geen verschillen in genexpressie detecteren na blootstelling aan Zn. Transcriptie van de SlZnT1 en SlZnT2 genen lijkt constitutief te zijn in S. luteus. Zn-tolerante en Zn-sensitieve isolaten verschillen echter in niveau van SlZnT2 expressie. Dit verschil in expressie kan (deels) veroorzaakt worden door een verschil in promotersequentie. Een breed arsenaal aan mechanismen inclusief exclusie, chelatie, compartementalisatie, anti-oxidatieve respons en herstelmechanismen is belangrijk voor metaaldetoxificatie in andere organismen. Het belang van deze mechanismen voor Zn-detoxificatie en adaptieve tolerantie in S. luteus wordt onderzocht in hoofdstuk 5. Genexpressie en enzymactiviteiten van hoofdrolspelers in verschillende detoxificatie “pathways” werden onderzocht in meerdere Zn sensitieve en Zn tolerante S. luteus isolaten. Daarnaast werden Zn, Fe en Mn concentratie en “TBARS” bepaald. Over het algemeen detecteerden we een grote intraspecifieke variatie op alle niveaus. Dit kan er op wijzen dat verschillende isolaten een andere strategie gebruiken om om te gaan met Zn stress. Selectie voor een hoge expressie van SlZnT2 vond plaats in Zn-tolerante S. luteus isolaten. Deze verhoogde expressie kan te wijten zijn aan genexpansie. Alle Zn-sensitieve isolaten bezitten één enkele SlZnT2 genkopie terwijl het aantal kopieën in Zn-tolerante isolaten variëert van twee tot zeven. SlZnT2 codeert voor een CDF-familie transporter waarvoor voorspeld wordt dat hij Zn transporteert en waarvan de cellulaire locatie onduidelijk is. Een verdere functionele karakterisatie van het gen is vereist om de bijdrage van deze transporter aan Zn-tolerantie in S. luteus te achterhalen. Een grondige functionele analyse van genen vereist een fenotypische analyse van overexpressie, “knock-down” of “knock-out” mutanten. Om mutanten te verkrijgen is een transformatie van het wild-type nodig. In hoofdstuk 6 doen we een poging om een Agrobacterium gemedieerd transformatieprotocol voor gebruik in S. luteus te bekomen. Agrobacterium tumefaciens gemedieerde transformatie is een krachtige techniek om genfunctie te bestuderen in fungi. De slaagkans van de transformatie is echter sterk afhankelijk van verschillende factoren. We waren in staat om zowel haploid monokaryotisch als dikaryotisch S. luteus mycelium te transformeren. Niettemin vertoonden alle verkregen mutanten een afwijkende morfologie. Deze afwijkende morfologie is gekarakteriseerd door vorming van mitosporen en melanine accumulatie. Hoogst waarschijnlijk is deze afwijkende morfologie niet direct gelinkt aan de mutatie maar eerder een effect van stress tijdens de periode van co-cultuur. Alvorens gebuik in functionele genstudies is een verdere optimalisatie van het protocol dan ook aangewezen. Ter conclusie: we observeerden een grote intraspecifieke variabiliteit in moleculair-genetische responsen na Cd en Zn behandeling in S. luteus. Dit zou kunnen betekenen dat er, tenminste op het moleculair-genetisch niveau, geen algemene strategie is om een overvloed aan metalen te detoxificeren en dat elk isolaat zijn eigen voorkeursmechanisme heeft voor het onderhoud van zijn metaalhomeostase. Alle Zn-tolerante isolaten werden echter geselecteerd voor een hoge SlZnT2 genexpressie. Deze verhoogde genexpressie wordt deels veroorzaakt door vermeerdering van het aantal genkopieën en potentieel ondersteund door verschillen in cis-regulatie. De functie van het SlZnT2 gen is onbekend en een verdere karakterisatie van het gen is vereist om zijn rol in adaptieve Zn-tolerantie in S. luteus te achterhalen. Omdat functionele genanalyse in ectomycorrhiza schimmels nog in zijn kinderschoenen staat, moeten technische obstakels eerst uit de weg geruimd worden.