The role of plant-associated bacteria in the remediation of soils and groundwater contaminated with petroleum hydrocarbons

Abstract

Among the wide variety of organic contaminants, in this study diesel has been chosen as the target substrate since its extensive use results in environmental contamination. Research related to microorganisms found at diesel contaminated sites has revealed the susceptibility of diesel constituents to bacterial degradation. Indeed the ability of microbes to utilize hydrocarbons as a source of energy was observed as early as the 1940´s (Zobell 1946). Numerous studies have demonstrated that under controlled and optimal laboratory conditions, it is relatively easy for many species of bacteria to degrade selected fractions of diesel oil, usually the n-alkanes, in a matter of days or weeks so that a specific percentage of oil by weight will disappear in a given period of time. It cannot be said that all diesel oil constituents will disappear at the same rate, given the range of chemical structures that make up this fuel. In nature, conditions are rarely favorable for maximum biodegradation; hence, the rate of diesel oil degradation can be slow and spilled oil may remain in the environment for periods that are longer than desirable. As such, bioremediation technologies can be applied to hasten remediation. Diesel remediation schemes may be improved if the resident microorganisms are able to produce surface-active agents (biosurfactants) and emulsifiers, form bioflims, exhibit chemotactic behavior towards diesel and tolerate heavy metals that are often found as cocontaminants. In field applications, the use of plants to facilitate hydrocarbon removal from soil and groundwater, known as phytoremediation, is an attractive approach. Further, the application of hydrocarbonoclastic bacteria able to enhance the growth of these plants can result in positive synergistic effects. In the Introduction of this thesis a detailed overview about the role of bacteria, plants and mixed bacterial-plant communities in hydrocarbon biodegradation is given. In Section 2, the overriding objectives of the thesis are summarized. In Section 3, the genotypic and phenotypic characterization of bacterial isolated from poplar trees growing in contact with a diesel-contaminated groundwater plume is presented. Here, 30 bacterial strains belonging to the genera Arthrobacter, Acinetobacter, Brevibacterium, Micorbacterium, Pseudomonas and Staphylococcus were found to show desirable properties both as petroleum hydrocarbon degraders and plant growth promoters. Furthermore, two root endophytes, Acinetobacter oleivorans and Acinetobacter calcoaceticus, and one rhizospheric strain, Staphylococcus aureus, were selected for a more detailed examination of their biodegradation potential in vitro using GC-MC analysis. The selected strains were grown in flasks with liquid minimal medium containing 1000 mg Kg-1 filter sterilized diesel oil, and compared to a positive control (Pseudomonas aerugionosa WatG). Analyses showed that Acinetobacter oleivorans degraded diesel oil up to 40%, Acinetobacter calcoaceticus 41%, whilst Staphylococcus aureus had the worst degradation potential at 27%. The identification of hydrocarbon degraders exhibiting promising plant growth properties provides evidence that the diesel contaminants at the study side selected for a microbial community rich in plant growth promoters with the ability to degrade aliphatic and aromatic hydrocarbons. This highlights the need for a more inclusive set of criteria when selecting bacteria for designing consortia with a high likelihood of success for use in in situ applications. Aside from their degradation potential strains should be evaluated for their ability to produce biosurfactants, their affinity to petroleum hydrocarbons, their biofilm formation potential, their tolerance to toxic solvents and metals, as well as their ability to produce plant growth promoting compounds. In the 4th Section of this thesis, the whole genome shotgun sequence of the diesel degrading and plant growth promoting root endophyte Acinetobacter oleivorans strain PF1 is presented. In the literature there is a scarcity of information relating to the effective turnover of organic contaminants for species of the Acinetobacter genus with plant growth-promoting properties. As reflected by the availability of complete genomes available in public databases, most reports on this topic are for species in other genera. For this work, genomic DNA of A. oleivorans PF1 was extracted from cells grown at 30o C in LB medium with a Qiagen blood and tissue kit (Qiagen N.V., Hilden, Germany) and a single 316v2-chip was used for sequencing on an IonTorrent PGM (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA). In total, 2.8 million reads (mean length 303 bases) generated 853 Mb of data, of which 535,611 reads were assembled using MIRA V3.9.9 into 31 contigs, giving a consensus length of 3,766,014 bp at 43.5× coverage. ORF prediction and gene annotation was carried out using RAST. This strain has a GC content of 38,6% and 3509 genes were arranged into 668 subsystems. In order to find the most closely related genome to use as a reference for gene prediction, the genomes of all fully sequenced and closely related bacterial strains on the NCBI database (Acinetobacter oleivorans DR1, Acinetobacter baumanii: 13 strains, Acinetobacter pittii ANC4050, Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2), along with sequences for Pseudomonas putida KT2440 and Escherichia coli CFT073, were aligned to the Acinetobacter oleivorans PF1 data using progressive MAUVE 2.3.1. Moreover, a new taxonomic metrics tool like average nucleotide identity (ANI), calculated from pair-wise comparisons of all sequences shared between two strains was performed. The gene context of gene clusters and the organization of specific operons was compared using the SeqinR1.0-2 package in R. For each gene and operon of interest the sequence of the genomic DNA fragment (”Query fragment”) was extracted, enlarged by two supplementary genes, one upstream and one downstream, prior to using BLAST to compare sequences to the NCBI bacterial genomes database. Matching sequences and gene coordinates of the best hits were downloaded to a GenBank file, and plotted against the”Query fragments”. Given this, a list of 10 biochemical mechanisms involved in diesel degradation and in plant-growth promotion was built, and validated through the review of 24 published studies, by carrying out keyword searches in various databases, and through identification of 219 "query” genes (37 as single genes and 182 genes that were part of one of 38 operons) that have been shown to code for proteins that are key players in hydrocarbon degradation and plant growth promotion. In conclusion, genome sequence analysis of A. oleivorans PF1 has provided us with significant insights into the genomic basis of PF1's: (i) Metabolic capability to degrade aliphatic and aromatic components present in diesel oil, (ii) Affinity and chemotaxis towards hydrocarbon substrates, (iii) responses to hydrocarbons and heavy metal stress and, (iv) key plant growth promotion properties. These findings support the hypothesis that A. oleiovorans PF1, based on its hydrocarbon degrading and emulsification abilities, together with its potential to promote host plant growth, is promising candidate for the development of novel strategies for the bioremediation of petroleum-contaminated sites by means of plant growth promoting and hydrocarbon degrading bacteria. Finally, the ANI calculation revealed a 91,83% similarity with Acinetobacter oleivorans DR1. The peculiar phenotypic and genotypic nature of strain PF1 together with its ANI estimation prompts for a tentative assumption that it represents a new species with the genus. In the 5th Section of this thesis, a greenhouse study is presented in which poplar cuttings [Populus deltoides x (trichocarpa x deltoides) cv Grimminge] were inoculated with a bacterial consortium consisting of two root endophytes, namely Acinetobacter oleivorans PF1 and A. calcoaceticus PF2, previously described for their ability to degrade diesel in liquid cultures and exhibit various plant growth-promoting traits in vitro. Inoculated and non-inoculated cuttings were exposed to 5000 mg kg-1 and 10000 mg kg-1 diesel oil and the biodegradation rate, plant growth index and microbial activity were monitored for a 10 weeks period. Despite the promising results at the lower concentration, at the higher concentration the inoculum did not exert any positive effect on the plants. Therefore further research is needed to unravel and record all the factors that may affect the application of bacterial co-cultures consisting of sequenced strains. Finally, in the 6th and last Section, the most important conclusions of the current project are summarized and perspectives for future studies are given.

Aangezien het grootschalig gebruik van diesel ernstige milieuvervuiling tot gevolg heeft, werd diesel in deze studie geselecteerd uit de grote variëteit aan organische contaminanten. Onderzoek omtrent micro-organismen die leven op diesel-gecontamineerde sites heeft aan het licht gebracht dat dieselcomponenten onderhevig kunnen zijn aan bacteriële afbraak. Inderdaad, de capaciteit van micro-organismen om koolwaterstoffen te gebruiken als energiebron werd reeds geobserveerd in 1946 (Zobell 1946). Talrijke studies hebben aangetoond dat, onder gecontroleerde, optimale labocondities, het voor vele bacteriesoorten relatief gemakkelijk is om bepaalde fracties van diesel olie af te breken. De n-alkanen worden meestal afgebroken in enkele dagen of weken, zodat een specifiek gewichtspercentage van de olie zal verdwijnen in een bepaalde tijdsperiode. Door de grote range in chemische structuren waaruit diesel is samengesteld, kan niet gesteld worden dat alle diesel olie componenten aan dezelfde snelheid zullen verdwijnen. Bovendien zijn de van nature in situ aanwezige condities zelden optimaal voor een maximale biodegradatie. Vandaar dat de snelheid van diesel olie afbraak traag kan zijn en bijgevolg de contaminaties voor veel langere periodes dan wenselijk in het milieu aanwezig blijven. In dit opzicht kunnen bioremediatie technologiën toegepast worden om de remediatie te versnellen. Diesel remediatie schema’s zouden verbeterd kunnen worden als de aanwezige micro-organismen in staat zijn om oppervlakte-actieve agentia (surfactanten) en emulgatoren te produceren, biofilms kunnen vormen, chemotaxis gedrag naar diesel vertonen, en zware metalen, die vaak als co-contaminant aanwezig zijn, kunnen tolereren. In veldtoepassingen is fytoremediatie, meer bepaald het gebruik van planten om de verwijdering van koolwaterstoffen uit bodems en grondwater te versnellen, een interessante techniek. Bovendien kan het gebruik van koolwaterstof afbrekende bacteriën die tegelijkertijd ook de groei en ontwikkeling van hun gastheer kunnen bevorderen, resulteren in een positief synergistisch effect. In de inleiding van dit doctoraat wordt een gedetailleerd overzicht gegeven van de rol van bacteriën, planten en plant-bacterie gemeenschappen bij de biodegradatie van koolwaterstoffen. Vervolgens worden in het tweede deel de algemene doelstellingen samengevat. De genotypische en fenotypische karakterisatie van de bacteriën, geïsoleerd uit populieren die groeien te midden van een diesel-gecontamineerde grondwaterpluim, wordt voorgesteld in deel 3. Van de geïsoleerde baceriële stammen, bleken er 30, die behoren tot de genera Arthrobacter, Acinetobacter, Brevibacterium, Micorbacterium, Pseudomonas en Staphylococcus, over interessante eigenschappen te beschikken, zoals petroleum koolwaterstof afbrekende, alsook plantengroei promoverende stammen. Bovendien werden 2 wortel endofyten, Acinetobacter oleivorans en Acinetobacter calcoaceticus, en 1 rhizosfeer stam, Staphylococcus aereus, geselecteerd voor een meer gedetailleerde analyse van hun in vitro biodegradatie potentieel, dit gebruik makend van GC-MS. De geselecteerde stammen werden gegroeid in erlemeyers met een vloeibaar minimaal medium dat 1000 mg Kg-1 filter-gesteriliseerde diesel bevatte, en werden vergeleken met een positieve controle (Pseudomonas aerugionosa WatG). De analyses toonden aan dat Acinetobacter oleivorans tot 40% diesel olie kon afbreken, Acinetobacter calcoaceticus 41%, en Staphylococcus aereus had het slechtste afbraak potentieel, nl. 27%. Het feit dat er stammen geïdentificeerd zijn die enerzijds koolwaterstoffen kunnen afbreken en anderzijds beschikken over veelbelovende plantengroei bevorderende eigenschappen, geeft aan dat de diesel contaminanten op de bestudeerde site een selectie geïnduceerd hebben ten voordele van plantengroei bevorderende stammen met het vermogen om alifatische en aromatische koolwaterstoffen af te breken. Dit benadrukt de noodzaak voor een meer inclusieve set van criteria bij de selectie van bacteriën voor het samenstellen van een consortium dat een hoge kans op succes heeft bij in situ toepassingen. Naast hun afbraakpotentieel, zou het interessant zijn de geïsoleerde stammen te testen voor hun capaciteit om biosurfactanten te produceren, hun affiniteit voor petroleum koolwaterstoffen, hun potentieel om biofilms te vormen, hun tolerantie voor toxische solventen en metalen, alsook hun capaciteit om plantengroei bevorderende componenten te produceren. In het vierde deel van dit werk wordt de ‘whole genome shotgun sequence’ van de diesel afbrekende en plantengroeibevorderende wortel endofyt Acinetobacter oleivorans stam PF1 voorgesteld. In de literatuur is zeer weinig informatie te vinden over de effectieve turnover van organische contaminanten voor species van het Acinetobacter genus die ook beschikken over plantengroei bevorderende eigenschappen. Dit blijkt ook wanneer de beschikbaarheid van volledige genomen in publieke databasen wordt aanschouwd: de meeste bevindingen omtrent deze topic betreffen soorten van andere genera. Voor dit werk werd het genomisch DNA van A. oleivorans PF1 cellen (gegroeid bij 30°C in LB medium) geëxtraheerd met een ‘Qiagen blood and tissue kit’ (Qiagen N.V., Hilden, Duitsland) en een enkel 316v2-chip werd gebruikt voor het sequeneren op een IonTorrent PGM (Life Technologies Inc., Carlsbad, CA). In totaal genereerden 2,8 miljoen reads (gemiddelde lengte 303 basen) 853 Mb aan data, waarvan 535.611 reads geassembleerd werden in 31 contigs (gebruik makend van MIRA V3.9.9). Dit resulteerde in een consensus lengte van 3.766.014 bp met 43,5x coverage. ORF predictie en gen annotatie werden uitgevoerd, gebruik makend van RAST. Deze stam had een GC gehalte van 38,6% en 3509 genen waren geördend in 668 subsystemen. Om het sterkst gerelateerde genoom te vinden, dat kan gebruikt worden als referentie voor gen predictie, werden de genomen van alle volledig gesequeneerde en sterk gerelateerde bacteriële stammen van de NCBI database (Acinetobacter oleivorans DR1, Acinetobacter baumanii: 13 stammen, Acinetobacter pittii ANC4050, Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2), alsook de sequenties van Pseudomonas putida KT2440 en Escherichia coli CFT073 gealigneerd met de data van Acinetobacter oleivorans PF1, gebruik makend van progressive MAUVE 2.3.1. Bovendien werden via een nieuwe taxonomische tool, zoals ‘average nucleotide identity’ (ANI), paargewijze vergelijkingen van alle sequenties die in beide stammen voorkomen berekend. De gen context van de gen clusters en de organisatie van specifieke operons werd vergeleken aan de hand van het SeqinR1.0-2 pakket in R. Vooraleer BLAST werd gebruikt om de sequenties te vergelijken met de NCBI bacteriële genoom database, werd voor elk interessant gen of operon de sequentie van het genomisch DNA fragment (“Query fragment”) geëxtraheerd, en uigebreid met 2 supplementaire genen: 1 upstream en 1 downstream. De sequenties en gen coördinaten van de beste hits werden gedownload naar de GenBank file en geplot tegen de “Query fragments”. Op deze manier werd een lijst opgebouwd van 10 biochemische mechanismen betrokken in diesel afbraak en plantengroeipromotie. Verder werd deze lijst gevalideerd a.h.v. de review van 24 gepubliceerde studies: er werd gebruik gemaakt van keyword searches in verschillende databasen en van identificatie van 219 “query” genen (37 afzonderlijke genen en 182 genen die deel uitmaakten van 1 van de 38 operons) waarvan werd aangetoond dat ze coderen voor proteïnen die een sleutelrol spelen bij koolwaterstof afbraak en plantengroeipromotie. Door heel deze genoom sequentie analyze van Acinetobacter oleivorans stam PF1 beschikken we over informatie omtrent de genomische basis van zijn (i) metabolische capaciteit om de alifatische en aromatische componenten aanwezig in diesel olie af te breken, (ii) zijn affiniteit en chemotaxis naar koolwaterstofsubstraten, (iii) zijn stressrespons na blootstelling aan koolwaterstoffen en zware metalen, (iv) en zijn belangrijkste plantengroeipromotie eigenschappen. Deze bevindingen ondersteunen de hypothese dat A. oleivorans PF1 een veelbelovende kandidaat is voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de bioremediatie van petroleumgecontamineerde sites en dit dankzij zijn capaciteit om koolwaterstoffen af te breken, en zijn emulsificatie en plantengroeipromotie potentieel. Tenslotte bleek uit de ANI berekening dat er slechts 91,83% gelijkenis was met Acinetobacter oleivorans DR1. Deze bevinding, tesamen met zijn uitzonderlijke fenotypische en genotypische kenmerken doen ons denken dat het hier mogelijk om een nieuwe species gaat. In het vijfde deel van dit doctoraat wordt een serre experiment beschreven waarin populier stekken [Populus deltoides x (trichocarpa x deltoides) cv Grimminge] geïnoculeerd werden met een bacterieel consortium bestaande uit 2 wortelendofyten, namelijk Acinetobacter oleivorans PF1 en A. calcoaceticus GK1, voorheen reeds beschreven o.w.v. hun diesel afbraak capaciteit in vloeibare cultuur en hun verschillende in vitro plantengroei bevorderende eigenschappen. Geïnoculeerde en niet-geïnoculeerde stekken werden blootgesteld aan 5000 mg kg-1 en 10.000 mg kg-1 diesel olie. De biodegradatiesnelheid, de plantengroei-index en de microbiële activiteit werden gedurende een periode van 10 weken opgevolgd. Ondanks de veelbelovende resultaten bij de lagere concentratie, had het inoculum geen positief effect op de planten bij de hogere concentratie. Daarom is verder onderzoek nodig om alle factoren die invloed kunnen hebben op de toepassing van bacteriële co-culturen bestaande uit gesequeneerde stammen te ontrafelen en weer te geven. Tenslotte worden in deel 6, het laatste deel, de belangrijkste conclusies samengevat en enkele toekomst perspectieven aangehaald.