Uranium-induced oxidative stress in Arabidopsis thaliana: influence of pH on uranium toxicity

Abstract

Uranium (U) is a naturally and commonly occurring radioactive element and heavy metal. Due to anthropogenic activities, such as U mining and milling, large areas have been contaminated with U. Uranium has a complex chemistry and its behaviour, mobility and bioavailability in the soil is strongly dependent on the U speciation. One of the important factors controlling the speciation is the pH value. Toxicity of U in plants (e.g. Arabidopsis thaliana), is mainly investigated in lab experiments under ideal growth conditions (pH 5.5). Through this, the contribution of different U species, generated through pH changes, has not been taking into account. Therefore, when evaluating the environmental impact of U contamination, it is important to investigate this under different environmentally relevant setups that can influence U toxicity. The main objective of this research is to analyse the effects of environmentally relevant parameters on U toxicity. The main focus is to investigate the influence of the pH on U toxicity at different levels of biological complexity (from the individual to the subcellular and molecular level) in order to study the mechanisms that play an important role in the U-induced stress responses in plants. Exposing plants to 25 µM U at different pH levels, ranging from 4.5 to 7.5 (chapter 4), resulted in a high uptake of U but only a limited fraction was transported to the leaves at low pH. At pH 7.5, less U was taken up by the roots, but it was more easily transported to the leaves. The differences in translocation can possibly be related to the differences in speciation. At low pH, the highly reactive uranyl ion (UO2 2+) was predicted to be the dominant U species present. This ion will precipitate with e.g. phosphate moieties present in root cell membranes leading to its immobilization. At higher pH, carbonate species are prevalent. They are less reactive and can therefore more easily be transported to the leaves. In addition to the large differences in U uptake and translocation, the biomass and the capacities of enzymes related to the antioxidative defence system were differentially affected at the different pH levels. To investigate the underlying mechanisms of U toxicity in more detail, dose-dependent responses were studied at pH 4.5 and pH 7.5 (chapter 5-7). Some U responses could be observed that were present at both pH levels. An increased MIR398b/c expression, which is involved in the regulation of the expression of specific genes of the antioxidative defence system, was observed after U exposure at both pH levels. As such, the role of miRNA398b/c in the regulation of the Uinduced oxidative stress responses was shown for the first time. In addition, U exposure induces the biosynthesis of ascorbate (AsA) in the leaves at both pH levels. Since an increased AsA content was also observed before in Arabidopsis thaliana plants exposed to U at pH 5.5, it seems that AsA plays an important role in the antioxidative defence mechanisms during U stress. In an attempt to elucidate the role of AsA in the U response, AsA deficient vtc mutants of Arabidopsis thaliana were exposed to 25 µM U (chapter 9). Since the miRNA398b/c response after U stress was more pronounced in the vtc mutants as compared to the wild-type plants, this further supports the hypothesis that AsA is a regulator of the U-induced stress responses. Based on the dose-response curves, the EC50 values for growth reduction were calculated. The EC50 value for the roots at pH 4.5 was about 2.5 times lower than the value observed at pH 7.5. In addition, a number of changes in the antioxidative pathway, such as the activation of miRNA398b/c, were observed at a lower U concentration at pH 4.5 as compared to pH 7.5. Finally, the AsA redox balance could not be determined in roots exposed to the higher U concentrations used at pH 4.5, indicating that those roots were seriously damaged, and a significant decrease in the GSH redox balance was observed. At pH 7.5, the AsA redox state shifted to the oxidized state, but the GSH redox balance could be maintained. These results indicate that U causes more adverse effects at low pH in the roots. This can possibly indicate that U is more toxic at low pH. In addition, the differences can possibly be explained by the fact that for similar nominal U concentrations, U was more readily taken up at low pH, possibly leading to more adverse effects. Although the U concentration in the leaves of U-exposed plants was low, a significant reduction in leaf fresh weight could be observed at both pH levels. Simlar as in the roots, the EC50 for leaf growth reduction at pH 4.5 was approximately two times lower than the EC50 value observed at pH 7.5. In addition, the concentration at which miRNA398b/c were activated was lower at pH 4.5 as compared to pH 7.5. Although the U concentration in the leaves of plants exposed to U at pH 4.5 was lower than at pH 7.5, those results indicate that U caused more adverse effects at low pH. This supports the hypothesis that U is more toxic at low pH. This can be related to differences in U speciation or to the involvement of root-to-shoot signalling. Since the roots exposed to U at low pH are seriously stressed, this can lead to the activation of defence reactions in the leaves via still unknown root-to-shoot signalling molecules. Since organisms are typically exposed to multiple stressors in the environment, the effects of U in combination with Cu were investigated (chapter 9). In the roots, the expression of LOX1, an enzyme involved in the production of reactive oxygen species, was induced 20 times after exposure to U and Cu as compared to the expression when U or Cu were applied as single stressors. Although more research is needed, this points towards an important role for LOX1 in the plant response when plants are exposed to a combination of U and Cu. In conclusion, the large differences in U uptake and translocation can be related to the different U species present at pH 4.5 and pH 7.5. Uranium seems to be more toxic at low pH, which can be attributed to a higher uptake of U but also to the high UO2 2+ concentrations present in the medium at low pH, which is supposed to be the most toxic U species. Although at pH 7.5 the U concentration in the leaves was about 3 times higher than at pH 4.5, most effects were observed at low pH. This possibly indicates an important role for root-to-shoot signalling. The differences in U toxicity at different pH levels observed in this research stress the need to take site-specific characteristics into account when making a risk assessment for U-contaminated areas.

Uranium (U) is een natuurlijk, veel voorkomend radioactief element en zwaar metaal. Door antropogene activiteiten zoals het ontginnen en verwerken van U werden grote gebieden gecontamineerd met U. Het gedrag, de mobiliteit en de biobeschikbaarheid van U in de bodem is sterk afhankelijk van de U speciatie die bepaald wordt door o.m. de zuurtegraad (pH). De toxiciteit van U op planten, waaronder Arabidopsis thaliana, werd tot nu toe voornamelijk onderzocht in labo-experimenten onder ideale groeicondities en dus enkel bij een pH van 5.5. De mogelijke bijdrage van de verschillende U species, gegenereerd door pH veranderingen, aan de toxiciteit wordt hierbij niet in rekening gebracht. Voor een correcte risicoanalyse van de impact van U verontreiniging op het milieu, is het daarom belangrijk om rekening te houden met de verschillende omgevingsparameters die de U toxiciteit kunnen beïnvloeden. De belangrijkste doelstelling van dit onderzoek is om de effecten van relevante omgevingsparameters op de U toxiciteit te onderzoeken. De focus ligt hierbij op de invloed van de pH op de toxiciteit van U op verschillende niveaus van biologische complexiteit: van het individuele tot het subcellulaire en moleculaire niveau. Dit geeft de mogelijkheid om mechanismen die belangrijk zijn voor de U toxiciteit in planten te bestuderen. Wanneer planten werden blootgesteld aan 25 µM U bij verschillende pH niveaus, variërend van 4.5 tot 7.5 (hoofdstuk 4), werd bij lage pH veel U opgenomen door de wortels, maar hiervan werd een relatief kleine fractie getransporteerd naar de blaadjes. Bij pH 7.5 werd er minder door de wortels opgenomen maar in verhouding meer naar de blaadjes getransporteerd. Dit verschil in translocatie naar de blaadjes kan mogelijk verklaard worden door het verschil in U speciatie bij de verschillende pH niveaus. Zo is bij pH 4.5 voornamelijk het reactieve uranyl ion (UO2 2+) aanwezig. Dit ion kan gemakkelijk binden aan vb. fosfaatgroepen die aanwezig zijn in de celmembranen waardoor het geïmmobiliseerd wordt. Bij pH 7.5 zijn voornamelijk U-carbonaten aanwezig. Deze zijn minder reactief en kunnen daardoor gemakkelijker naar de blaadjes getransporteerd worden. Naast het grote verschil in U opname en translocatie werden ook verschillen gevonden op biomassa en op de capaciteiten van de enzymen betrokken in het antioxidatieve verdedigingssysteem. Om de onderliggende mechanismen van U toxiciteit meer in detail te bestuderen, werden de dosis-afhankelijke responsen bij pH 4.5 en pH 7.5 bestudeerd (hoofdstuk 5-7). Hierbij werden enkele U responsen geïdentificeerd die bij beide pH niveaus aanwezig waren. Zo lijkt miRNA398b/c, dat betrokken is bij de regulatie van de expressie van bepaalde genen van het antioxidatieve verdedigingssysteem, een belangrijke rol te spelen in de U-geïnduceerde stress reacties. Na U blootstelling werd namelijk een stijging van de MIR398b/c expressie waargenomen zowel in de blaadjes als in de wortels en dit voor beide pH niveaus. Uraniumblootstelling induceert ook de biosynthese van ascorbate (AsA) bij pH 4.5 en pH 7.5, wat ook al geobserveerd was indien planten blootgesteld werden aan U bij pH 5.5. Dit kan wijzen op een belangrijke rol voor dit metaboliet in de antioxidative verdedigingsmechanismen tijdens U stress. Om de rol van AsA verder te onderzoeken werden Arabidopsis thaliana planten met een verlaagd AsA gehalte (vtc mutanten) blootgesteld aan 25 µM U (hoofdstuk 9). Vermits de miRNA398b/c respons onder U stress meer uitgesproken was in de vtc mutanten dan in de wild-type planten, lijkt dit de hypothese te bevestigen dat AsA een regulator is van de U-geïnduceerde stress responsen. Op basis van de dosis-respons curves, werd een EC50 waarde berekend voor de groeireductie. De EC50 waarde in de wortels bij pH 4.5 was ongeveer 2.5 keer lager dan deze bij pH 7.5. De veranderingen in de antioxidatieve verdedigingsmechanismen, waaronder de activatie van miRNA398b/c, gebeurde bij lagere U concentratie bij pH 4.5 in vergelijking met pH 7.5. Daarnaast kon de AsA redox balans niet bepaald worden in de wortels die blootgesteld werden aan de hogere U concentraties bij pH 4.5, wat erop wijst dat de wortels ernstig beschadigd waren. Ook werd in deze wortels een daling in de glutathion (GSH) redox balans waargenomen. In de wortels blootgesteld bij pH 7.5 verschoof de AsA redox balans naar de geoxideerde toestand, maar de GSH redox balans kon behouden blijven. Uit deze resultaten lijkt het dat U in de wortels meer toxisch is bij lage pH. Dit kan te wijten kan zijn aan een verschil in U speciatie maar kan mogelijk ook verklaard worden door het feit dat bij gelijke nominale U concentraties, meer U opgenomen werd bij een lage pH, wat mogelijk kan leiden tot meer nadelige effecten. In de blaadjes was de U concentratie laag maar werd toch een significante daling in het versgewicht waargenomen bij beide pH niveaus. Net als in de wortels was de EC50 waarde voor groeireductie in de blaadjes bij pH 4.5 ongeveer 2 keer lager dan deze bij pH 7.5. Ook was de concentratie waarbij miRNA398b/c geactiveerd werd bij pH 4.5 lager in vergelijking met pH 7.5, hoewel de U concentratie in de blaadjes bij pH 7.5 hoger is dan bij pH 4.5. Deze resultaten wijzen er weer op dat U meer toxische effecten veroorzaakt bij lage pH, wat mogelijk te wijten kan zijn aan een verschil in speciatie. Een andere mogelijke verklaring voor deze resultaten is de signalering van wortel naar blad. Omdat de U-blootgestelde wortels bij lage pH ernstig gestresseerd zijn, kan dit leiden tot de activatie van verdedigingsmechanismen in de blaadjes via tot nu toe onbekende moleculen. Omdat organismen meestal blootgesteld worden aan meer dan één stressor, werd ook het effect van U in combinatie met Cu onderzocht (hoofdstuk 9). Zo werd in de wortels na blootstelling aan U+Cu de expressie van LOX1, een enzym betrokken in de productie van reactieve zuurstofspecies, 20 maal geïnduceerd ten opzichte van de expressie geobserveerd indien U en Cu apart toegediend werden. Hoewel meer onderzoek nodig is duidt dit op een belangrijke rol van LOX1 in de respons van planten na blootstelling aan U en Cu. Als conclusie kunnen we stellen dat de verschillen in U opname en translocatie gerelateerd kunnen worden aan de verschillende U species die aanwezig zijn bij pH 4.5 en pH 7.5. Ook lijkt U meer toxisch bij lage pH, wat te wijten kan zijn aan een hogere opname van U, maar ook aan de hoge concentratie van UO2 2+ in het medium, sinds deze vorm van U wordt beschouwd als de meest toxische. Hoewel de U concentratie in de blaadjes bij pH 7.5 ongeveer 3 keer hoger was dan bij pH 4.5, werden de meeste effecten waargenomen bij lage pH. Dit kan wijzen op een belangrijke rol voor signalering van wortel naar blad. De verschillen in U toxiciteit bij verschillende pH niveaus die tijdens dit onderzoek geobserveerd werden, wijzen op het belang om rekening te houden met plaatsspecifieke karakteristieken wanneer men een inschatting maakt van de nadelige effecten van U in de omgeving.