Phytotoxic concentrations of copper and zinc induce antioxidative defence in Phaseolus vulgaris, cv. Limburgse vroege : A comparative Study

Abstract

Bean seedlings (Phaseolus vulgaris cv. Limburgse vroege) were grown under strictly controlled conditions on a Hoagland nutrient solution. Ten days old seedlings were treated with toxic concentrations of copper (15 or 50 μM) or zinc (50 μM). During a time course of 1 week samples were taken to investigate the contribution of several biochemical defence mechanisms against this metal imposed stress. Metals are known to induce oxidative stress, therefore the impact of both copper (as a representative of redox active metals) and zinc (not redox active) in roots and primary leaves on the antioxidative defence mechanism was highlighted. This study of the antioxidative defence mechanism covers the constituents of the ascorbate-glutathione cycle and of some enzymes capable of quenching reactive oxygen species as well as enzymes which catalyse reactions leading to the reduction of NAD(P)+. At the root level both metals oxidize the ascorbate and glutathione pools: copper through a direct chemical process and oxidation occurs indirectly after zinc application since this metal is not able to perform one electron oxidoreduction reactions. The results obtained in the present study reveal that the antioxidative defence in the roots is clearly different. Whereas in copper treated plants an efficient defence mechanism is activated, no induction of such a defence system was observed in the roots after zinc treatment. In the primary leaves several biochemical parameters of the defence system were enhanced after application of both metals to the nutrient solution. It was observed that for several enzymes an increase in capacity occurred before the metal (copper or zinc) content in the primary leaves was elevated. This quick response might be the result of a signal transduction mechanism. After the copper content in the primary leaves was elevated, a supplementary oxidation of the antioxidative metabolites was noticed. Therefore two different phases were observed in the defence system after copper treatment, which was not seen when zinc was applied. The sequence of inductions of this antioxidative defence was metal dependent. This suggests that the chemical behaviour of the metal applied plays a principal role in the induced defence strategy. Copper is a transition metal which easily performs monovalent oxidoreduction reactions. Zinc on the other hand only occurs as a bivalent cation. Consecutively, both elements react differently with the cellular metabolism leading to different reactions against this metal stress. In both plant organs, the defence mechanism responded differently. Therefore it can be postulated that induction of the defence strategy is dependent on metal speciation. Roots are in direct contact with the nutrient solution and hence with the metal ions applied to the nutrient solution. Transport to the aerial plant parts have been shown to occur mostly in complexed form, which may be less harmful. Since both metals demonstrate different affinities towards sulfhydryl groups, it was investigated whether the formation of phytochelatins, metal binding peptides, was affected. Neither copper nor zinc treatment resulted in the formation of these phytochelatins. This suggests that in seedlings of Phaseolus vulgaris cv. Limburgse vroege, phytochelatin formation does not contribute to the defence against copper or zinc imposed oxidative stress. In a final chapter it was investigated whether copper stress can induce the production of new proteins. After analysis of two dimensional gel electrophoresis, formation of new proteins was observed. Identification of some proteins revealed that they belong to the group of PR proteins. To obtain a better understanding of the plant defence mechanism, a detailed study of the underlying molecular regulation is required.

Bonenzaailingen (Phaseolus vulgaris cv. Limburgse vroege) werden opgekweekt onder klimatologisch vaste omstandigheden op een Hoagland voedingsoplossing. Tien dagen oude kiemplanten werden behandeld met koper (15 of 50 μM) of zink (50 μM). Gedurende een week werden op verschillende ogenblikken stalen genomen om de respons van verschillende biochemische parameters tegen deze metaalstress te bestuderen. Algemeen wordt gesteld dat metalen oxidatieve stress kunnen induceren, de impact van koper en zinktoxiciteit op de wortels en primaire bladeren op het antioxidatief verdedigingsmechanisme werd daarom onderzocht. Het antioxidatief verdedigingsmechanisme, bestudeerd in dit onderzoek, bestaat uit 3 luiken: de ascorbaat-glutathion cyclus, enzymen die reactieve zuurstofvormen catalyzeren en enzymen die in hun reacties het coenzyme NAD(P)+ reduceren. In de wortel worden ascorbaat en glutathion geoxideerd door beide metalen: via een direct chemisch proces door koper en indirect bij zink aangezien dit metaal geen univalente redox reacties kan uitvoeren. De resultaten tonen aan dat er een duidelijk verschil is tussen de biochemische responsen in de wortel afhankelijk van het metaal. In koper behandelde planten wordt een efficiënt verdedigingsmechanisme geactiveerd. Na behandeling met zink kon dit niet worden waargenomen in de wortels. In de primaire bladeren werd de hoeveelheid en/of activiteit van verscheidene biochemische parameters van het verdedigingssysteem verhoogd na behandeling met beide metalen. In een aantal gevallen werd deze toename reeds waargenomen alvorens het metaalgehalte steeg in de bladeren. Deze vlugge respons kan het gevolg zijn van een signaaltransductie mechanisme. Nadat het kopergehalte in het blad verhoogde, werd een supplementaire chemische oxidatie van de antioxidatieve metabolieten vastgesteld. Bijgevolg worden in het verdedigingssysteem 2 fasen onderscheiden na koperbehandeling, die niet wordt waargenomen na toediening van zink. De bijdrage van dit antioxidatief verdedigingssysteem blijkt afhankelijk te zijn van het toegediende metaal. De chemische eigenschappen van het metaal zijn dus zeer belangrijk in de resulterende stress en bijgevolg ook in het verdedigingsmechanisme ertegen. Koper is een transitiemetaal dat gemakkelijk univalente oxidoreductie reacties kan catalyzeren. Zink daarentegen komt enkel voor als bivalent kation. Een verschillende respons in het cellulair metabolisme kan dus verwacht worden en bijgevolg eveneens andere reacties om de plant tegen deze metaal geïnduceerde stress te beschermen. In beide plantorganen werd een verschillende activering van het verdedigingssysteem waargenomen. Dit is waarschijnlijk te wijten aan metaalspeciatie. Wortels staan in direct contact met de voedingsoplossing en dus ook met de toegediende metaalionen. Tijdens het transport naar de bovengrondse delen, zijn metalen meestal gecomplexeerd met organische of inorganische componenten, die vaak minder schadelijk zijn. Aangezien beide metalen een verschillende affiniteit voor sulfhydryl groepen vertonen, werd nagegaan hoe de vorming van fytochelatinen, metaal-bindende peptiden, door beide metalen wordt beïnvloed. Koper noch zink had een productie van fytochelatinen tot gevolg. In onze kiemplanten, Phaseolus vulgaris cv. Limburgse vroege, speelt vorming van deze peptiden dus geen rol in het verdedigingssysteem. In een laatste hoofdstuk werd onderzocht of koperstress de vorming van nieuwe eiwitten induceert. Na analyse met behulp van 2D gelelectroforese kon de productie van nieuwe eiwitten worden aangetoond. Identificatie toonde aan dat deze eiwitten behoren tot de groep van de 'pathogen-related' eiwitten. Om een beter inzicht te verwerven in het verdedigingsmechanisme, is het noodzakelijk om de onderliggende moleculaire processen te bestuderen.