Chemical and biological factors influencing heavy metal mobilisation in the rhizosphere implications for phytoremediation

Abstract

The thesis aims at investigating the potential of phytoremediation on a heavy metal contaminated soil with very low nutrient content, low organic carbon and acidic pH. The soil originates from the Ronneburg mining district in Thuringia (Germany) which was the third largest uranium-producing area worldwide. The mining activities strongly altered the hydrogeology of the area. The acidic and highly mineralised solutions caused by leaching of waste heaps infiltrated into the soil and underlying sediments and polluted the water-soil system with high concentrations of Mn, Al, Ni, U, and Rare Earth Elements (REE). Despite remediation activities since the 1990s, contamination is still measurable. Since the soil pH is quite low (pH 4-4.5), the mobility and bioavailability of trace elements is high and so the amounts taken up by plants are significant. So, to study the interaction between soil trace elements and plants, in particular via root exudates, four plant species were chosen: Triticale (× Triticosecale), sunflower (Helianthus annuus), red fescue (Festuca rubra) and red clover (Trifolium pratense), grown as monoculture and polyculture. The last two were used for microbial studies, including the isolation and characterisation of endophytes potentially useful for remediation enhancement. The substrate at the study area has been extensively characterised, and sequential extraction already allowed predictions about possible bioavailability of metals. However, the active influence of plants and their root exudates were not taken into consideration. Therefore, in a first part, REE will be used as a way to study root impact on element mobilisation, by comparing leaching by different organic and inorganic solutions. REE form a consistent group of so called metals, whose pattern, resulting from normalisation to a standard, can be used to describe different processes of dissolution and preferential precipitation. Our study shows that metals (REE) are mobilised in a different way by acidic solutions of different origin, and that organic acids lead to a different fractionation than inorganic ones. REE pattern changes were also observed in plants and their rhizosphere. The amounts of soluble trace elements decreased in the rhizosphere zone, while pH increased. Based on the analysis of REE patterns, it seemed that organic substances, like organic acids were an important factor that mobilises metals in the rhizosphere and allows their uptake into the plant. Furthermore, combined cultivation generally had a beneficial effect on plant growth; plants showed later necrosis and had a higher biomass production in relation to the initial seed quantity. Plants also had a clear effect on the soil structure: especially clover and red fescue were producing extended root networks, holding the soil. Festuca especially retained water. These features were considered to be interesting for remediation in sites with an erosion risk. Microorganisms living around and inside the plants also influence their growth and mineral uptake. If more is known about these, they can be used, if chosen well, to enhance phytoremediation processes, especially on soil poor in nutrients. In the present study we concentrated on bacteria living inside the plant tissues, and isolated, characterised and finally identified the cultivable ones. 78 stable, morphologically distinct isolates were obtained, belonging to 32 genera, although 12 isolates could not be identified. The identified endophytic community was different for the 2 studied plants, so it seems that a selection took place. The endophytic bacteria showed additionally clear spatial compartmentalisation within the plant, suggesting that they can form specific associations with plant tissue. Furthermore, the specificity of some strains for some compartments suggests that different uptake mechanisms for different plant tissues exist. They were found to be more diverse in the upper parts of the plants. Nevertheless, several strains isolated from roots could not be identified. Many of the isolated genera are very similar to known plant endophytes, and a large number of them are also related to strains used to support phytoremediation, mostly on sites contaminated with organic pollutants. A number of isolates demonstrated the capacity to produce plant growth promoting substances and resistance to the trace elements enriched in the contaminant soil. As a consequence, some of these strains were used to promote growth of Festuca rubra and Trifolium pratense, and were inoculated separately to each plant and also as bacterial consortia of 2 or 3 strains. The inoculated plants showed better growth, higher plant density, healthier appearance, better and denser developed root network which, by consequence, was leading to a better soil structure. Moreover, the inoculated plants showed a higher photosynthetic efficiency, which can be interpreted as an improved fitness due to a better stress resistance. Further, the positive effect of the bacteria is enhanced in case consortia of strains are used. The effect of bacteria on trace element mobility and metal uptake depends mainly on the element itself: for instance Al was less present in the soluble fraction of the soil, and Mn more mobile in the soil after the combined action of plants and microbial consortia. Zn on the other hand was not influenced. As the studied plants have a clear influence on metal mobility and pH, it is useful to use wisely their properties for remediation purposes. There is a large number of symbiotic bacteria described, which are living inside their tissue, and a notable part of them show promising properties for the support of plant growth and remediation. We suggest therefore using Festuca and Trifolium as complement to extracting, hyper-accumulating plants or to stabilising plants, in order to increase soil fertility and protection of soil erosion via the dense root network. Festuca is more influenced by bacteria concerning its root development, so should therefore get particular attention when it comes to choosing plant populations for remediation. It is also of importance to combine plants of different species to ensure longterm system stability.

FR La thèse vise à étudier le potentiel de la dépollution par les plantes (phyto-assainissement) sur un sol contaminé par des métaux lourds, pauvre en éléments nutritifs, avec une faible teneur en carbone organique et un pH acide. Le sol provient de l’ancienne exploitation minière du district de Ronneburg, en Thuringe (Allemagne), qui était le troisième producteur mondial d'uranium. Les activités minières ont profondément altéré l'hydrogéologie de la région. Les solutions acides et fortement minéralisées, produites par la lixiviation des terrils, se sont infiltrées dans le sol, et ont pollué le système eau-sol avec des quantités élevées d'uranium, Terres Rares et autres éléments toxiques, principalement Mn, Al et Ni. Malgré les activités d'assainissement entreprises depuis les années 1990, le niveau de contamination est toujours mesurable dans plusieurs endroits du site. Le pH du sol étant assez bas (pH 4-4,5), la mobilité et la biodisponibilité des métaux sont élevées et les quantités absorbées par les plantes sont importantes. Afin d’étudier l'interaction entre les oligo-éléments du sol et les plantes, en particulier à travers les exsudats racinaires, quatre espèces de plantes ont été choisies: le triticale (× Triticosecale), le tournesol (Helianthus annuus), la fétuque rouge (Festuca rubra) et le trèfle violet (Trifolium pratense), cultivées en monoculture et polyculture. Seules les deux dernières ont été utilisées pour les examens microbiologiques, incluant l’isolation et la caractérisation de bactéries endophytes potentiellement utiles pour l’amélioration de l’assainissement. Le sol de la zone d'étude a été largement caractérisé, et l'extraction séquentielle a été utilisée pour estimer la biodisponibilité potentielle de certains éléments toxiques. Cependant, l'influence active des plantes et leurs exsudats racinaires n’ont pas été pris en considération. Par conséquent, dans une première partie, les Terres Rares sont utilisés comme outil pour étudier l’impact des racines sur la mobilisation des métaux, en comparant la lixiviation du sol avec différentes solutions organiques et anorganiques. Les Terres Rares forment un groupe cohérent de métaux, et sont généralement graphiquement représentés sur un diagramme de distribution obtenu après la normalisation à un standard. Le motif varie en fonction des conditions physico-chimiques du système, et peut être utilisé pour décrire différents procédés notamment de dissolution et de précipitation. Notre étude montre que les métaux (dont les terres rares) sont mobilisés d'une manière distincte par différentes solutions acides, et que les acides organiques conduisent à un fractionnement spécifique de celui causé par les acides inorganiques. Les terres rares ont également montré des changements de leur motif dans les plantes et leur rhizosphère. La part de métaux solubles a été diminuée dans la zone rhizosphère, tandis que le pH a été augmenté. En se basant sur l'analyse des motifs de terres rares, il semble que les substances organiques comme par exemple des acides organiques ont été un facteur important pour la mobilisation des métaux dans la rhizosphère et par conséquent pour leur absorption dans la plante. De plus, la polyculture s’est montrée bénéfique pour les plantes: elles montrent une nécrose plus tardive, et ont une production supérieure de biomasse par rapport à la quantité de semis initiale. Cela est particulièrement visible pour le trèfle. Les plantes ont aussi eu un effet manifeste sur la structure du sol: en particulier le trèfle et la fétuque rouge ont produit un réseau de racines longues qui tient le sol. Particulièrement avec Festuca la retenue d'eau était importante. Ces caractéristiques sont intéressantes pour l'assainissement dans les sites présentant un risque d'érosion. De nombreux organismes vivant autour des plantes peuvent influencer leur croissance et l’assimilation de minéraux. Une connaissance plus approfondie de ces micro-organismes et de leurs propriétés permettrait de les utiliser, choisis judicieusement, pour améliorer les techniques d’assainissement par les plantes, en particulier sur des sols pauvres en nutriments. Nous nous sommes concentrés dans la présente étude sur les bactéries vivant à l'intérieur des tissus végétaux (endophytes), et avons isolé, caractérisé et enfin identifié les endophytes cultivables. 78 isolats stables, morphologiquement distincts ont été obtenus, appartenant à 32 genres; 12 isolats n'ont pas pu être identifiés. La communauté endophyte identifiée était différente pour les 2 plantes étudiées, il semble donc qu’une sélection spécifique pour chaque espèce ait eu lieu. Les bactéries endophytes ont montré en outre, clairement la compartimentation spatiale au sein de la plante, ce qui suggère qu'elles peuvent former des associations caractéristiques avec certains tissus végétaux. Ensuite, la spécificité de certaines souches pour certains compartiments suggère qu’il existe des mécanismes d’assimilation divergents pour différents tissus végétaux. La diversité était plus élevée dans les parties supérieures des plantes. Néanmoins, plusieurs souches isolées des racines n'ont pas pu être identifiées. La plupart des genres sont connus pour être des endophytes de plantes, et beaucoup d'entre eux sont également utilisés pour améliorer le phyto-assainissement, surtout sur les sites contaminés par des polluants organiques. Un certain nombre d'isolats ont démontré la capacité de produire des substances favorisant la croissance végétale et la résistance aux métaux toxiques présents dans le sol. En conséquence, certaines de ces souches ont été utilisées pour promouvoir la croissance de Festuca rubra et Trifolium pratense, et ont été inoculées séparément pour chaque plante ainsi que par consortiums bactériens de 2 ou 3 souches. Les plants inoculés ont montré une meilleure croissance, une densité de plants par pot supérieure, une apparence plus saine, un réseau de racines mieux développé et plus dense, qui a, par conséquent, conduit à une meilleure structure du sol. Les plantes inoculées ont montré une plus grande efficacité photosynthétique, qui peut être interprétée comme une meilleure santé en raison d'une résistance supérieure au stress. En outre, l'action positive des bactéries est renforcée dans le cas d’inoculation de consortiums de souches. L'effet des bactéries sur la mobilité l'absorption des métaux dépend surtout de l'élément lui-même: par exemple, l’aluminium était moins présent dans la fraction soluble du sol, et le manganèse plus mobile dans le sol après l'action combinée des plantes et des consortiums microbiens. La solubilité du zinc, d'autre part n'a pas changé. Comme les plantes étudiées ont une influence évidente sur la mobilité des métaux et le pH, il est utile d'utiliser judicieusement leurs propriétés pour la dépollution. Un grand nombre de bactéries symbiotiques vivant à l'intérieur de leurs tissus ont été décrites, et une partie importante d'entre elles présente des propriétés prometteuses pour le soutien de la croissance des plantes et l'assainissement. Nous suggérons donc d'employer Festuca et Trifolium en tant que complément à des plantes utilisées pour l'extraction, notamment des plantes hyperaccumulatrices, ou bien des plantes stabilisatrices, afin d'accroître la fertilité du sol et comme protection contre l'érosion, en raison de leur réseau racinaire dense. Festuca est plus influencée par des bactéries concernant le développement de ses racines, et devrait donc faire l’objet d’une attention particulière dans l’avenir quand il s'agira de choisir les populations de plantes pour l'assainissement. Il est également important de combiner des plantes de différentes espèces, pour assurer la stabilité du système à long terme.

DE Diese Arbeit befasst sich mit der Untersuchung des Potenzials für Phytoremediation auf einem mit Schwermetallen kontaminierten Boden mit sehr geringem Nährstoffgehalt, niedrigem organischem Kohlenstoffgehalt und saurem pH-Wert. Der Boden stammt aus dem ehemaligen Bergbaugebiet Ronneburg in Thüringen (Deutschland), das der drittgrößte Uranproduzent weltweit war. Die Bergbauaktivitäten veränderten tiefgehend die Hydrogeologie des Gebietes. Die sauren und stark mineralhaltigen Abwässer, die durch Auslaugen der Halden entstanden, sickerten in den Boden und kontaminierten das WasserBoden-System mit hohen Mengen an Mangan, Aluminium, Nickel, Uran sowie Seltenen Erdelementen (SEE). Trotz umfangreicher Sanierungsaktivitäten seit den 1990er Jahren xx ist die Kontamination noch an vielen Stellen messbar. Da der Boden-pH ziemlich sauer ist (pH 4-4,5), ist die Mobilität und Bioverfügbarkeit von Spurenelementen hoch und die von Pflanzen aufgenommen Mengen signifikant. Um die Wechselwirkung zwischen Bodenelemente und Pflanzen zu untersuchen, insbesondere durch die Wurzelexudate, wurden vier Pflanzenarten ausgewählt: Triticale (× Triticosecale), Sonnenblumen (Helianthus annuus), Rotschwingel (Festuca rubra) und Rotklee (Trifolium pratense), die als Monokutur sowie als Polykultur kultiviert wurden. Nur die beiden letzten Pflanzenarten wurden für spätere mikrobiologische Untersuchungen verwendet, insbesondere für die Isolierung und Charakterisierung von potentiell nützlichen Endophyten in Hinblick auf Sanierungszwecke. Das Substrat wurde umfassend charakterisiert und mithilfe sequentieller Extraktion konnten bereits Aussagen über den bioverfügbaren Metallanteil getroffen werden. Allerdings wurde der aktive Einfluss von Pflanzen und deren Wurzelausscheidungen nicht berücksichtigt. Daher werden im ersten Teil SEE zur Hilfe gezogen, um den Einfluss von Wurzelexudaten zu untersuchen, indem Elutionen mittels verschiedener organischer sowie anorganischer Lösungen und die daraus entstandenen SEE Muster verglichen werden. SEE bilden eine konsistente Gruppe von so genannten Metallen, deren Muster, das sich aus der Normalisierung zu einem Standard ergeben, für die Beschreibung unterschiedlicher Lösungsund Präzipitationsprozesse benutzt werden kann. Unsere Studie zeigt, dass Metalle (inkl. SEE) in unterschiedlicher Weise durch verschiedene saure Lösungen mobilisiert werden und dass organischen Säuren zu einer anderen Fraktionierung führen als anorganische. SEEMuster Veränderungen wurden auch in den Pflanzen und in ihrer Rhizosphäre beobachtet. Die Menge löslicher Spurenelemente nahm in der Rhizosphärenzone ab, während der pHWert zunahm. Basierend auf der Analyse von SEE-Mustern scheint es, dass organische Substanzen wie organische Säuren ein wichtiger Faktor sind, der Metalle in der Rhizosphäre mobilisiert und deren Aufnahme in die Pflanze ermöglicht.Weiters ergab sich, dass die Polykultur einen positiven Effekt auf die Pflanzen hatte; sie zeigten später Nekrosen und hatten eine höhere Biomasseproduktion in Bezug auf die ursprüngliche Menge Samen. Die Pflanzen hatten auch eine deutliche Wirkung auf die Bodenstruktur: vor allem Klee und Rotschwingel produzierten ein stark ausgebildetes Wurzelnetzwerk, das den Boden festigt; insbesondere Festuca konnte dadurch viel Wasser zurückhalten. Diese Eigenschaften sind vor allem für die Sanierung von Standorten mit Erosionsgefährdung wichtig. Die Pflanzen und ihre Spurenelement-Aufnahme können durch viele andere Faktoren beeinflusst werden, da sie einen eigenen Mikrokosmos in ihrer Rhizosphäre bilden. Mikroorganismen, die um und in der Pflanze leben, beeinflussen ebenfalls deren Wachstum und Mineralstoff-Aufnahme. Wenn mehr über diese bekannt ist, können sorgfältig ausgewählte unter ihnen verwendet werden, um Phytosanierungsprozesse, inbesondere auf nährstoffarmen Böden zu verbessern. In der vorliegenden Studie wurde der Fokus auf Bakterien, die innerhalb des Pflanzengewebes leben, gerichtet und die kultivierbaren unter ihnen wurden isoliert, charakterisiert und schließlich identifiziert. Es ergaben sich 78 stabile, morphologisch unterschiedliche Isolate, aus 32 Gattungen; 12 Isolate konnten aber nicht identifiziert werden. Die identifizierte endophytische Population war unterschiedlich für die 2 untersuchten Pflanzen, anscheinend fand eine Selektion statt. Die endophytischen Bakterien zeigten außerdem eine klare räumliche Trennung innerhalb der Pflanze, was darauf hindeutet, dass sie charakteristische Assoziationen mit bestimmten pflanzlichen Geweben bildeten. Darüber hinaus deutete die Spezifität einiger Stämme für bestimmte Kompartimente auf unterschiedliche Aufnahmemechanismen für unterschiedliche Pflanzengewebe hin. Die Diversität war größer in den oberen Pflanzenteilen. Allerdings konnten mehrere Stämme aus den Wurzeln nicht identifiziert werden. Viele der gefundenen Gattungen sind bekannten Pflanzenendophyten ähnlich und viele von ihnen werden auch verwendet, um Phytosanierung zu unterstützen, vor allem auf Standorten, die mit organischen Kontaminanten belastet sind. Eine beachliche Anzahl der Isolaten zeigte Resistenz gegen toxische Metalle, die in dem Substrat vorhanden sind, sowie die Fähigkeit, Pflanzenwachstum fördernde Substanzen zu bilden. Daher wurden einige dieser Stämme verwendet, um das Wachstum von Festuca rubra und Trifolium pratense zu fördern; sie wurden einzeln sowie als Konsortien von 2 oder 3 Stämmen inokuliert. Die inokulierten Pflanzen zeigten ein besseres Wachstum, eine höhere Pflanzendichte, gesünderes Aussehen, ein besser und dichter entwickeltes Wurzelsystem, das zu einer besseren Bodenstruktur führte. Die inokulierten Pflanzen zeigten außerdem eine höhere photosynthetische Effizienz, die als eine verbesserte Stressresistenz interpretiert werden kann. Weiters ist die positive Wirkung der Bakterien erhöht, wenn mikrobielle Konsortien verwendet werden. Die Wirkung von Bakterien auf Spurenelement-Mobilität und Metallaufnahme hängt vor allem von dem Element selbst ab: zum Beispiel war Aluminium nach der kombinierten Wirkung von Pflanzen und mikrobiellen Konsortien in geringeren Mengen in der löslichen Fraktion des Bodens vorhanden und Mangan im Gegenteil mobiler im Boden. Zink andererseits wurde nicht beeinflusst. Da die verwendeten Pflanzen eine klare Wirkung auf die Metallmobilität und den pH-Wert zeigen, ist es von Vorteil diese Eigenschaften gezielt zu nutzen. Eine große Anzahl an endosymbiotischen Bakterien wurde beschrieben und ein großer Anteil davon zeigt vielversprechende Eigenschaften für die Verbesserung von Pflanzenwachstum und Phytoremediation. Wir empfehlen daher die Verwendung von Festuca und Trifolium als Ergänzung zu extrahierenden, Metall-Hyperakkumulator Pflanzen, oder zu stabilisierenden Pflanzen, um einerseits die Bodenfruchtbarkeit zu erhöhen und andererseits als Erosionsschutz wegen des dichten Wurzelwerks. Am meisten wird die Wurzelentwicklung von Festuca durch Bakterien beeinflusst, daher sollte bei der Auswahl von Pflanzenarten für die Sanierung dieser Pflanze besondere Aufmerksamkeit gewidmet werden. Es könnte auch hilfreich sein, Pflanzen verschiedener Arten zu kombinieren, um eine langfristige Stabilität des Systems zu gewährleisten.