The role of endophytes and copper nanoparticles in the success or failure of DDE phytoremediation using Cucurbita pepo

Abstract

2,2-bis(p-chlorophenyl)-1,1,1-trichloroethane (DDT) was produced and applied as a pesticide starting in 1939, and was used globally by 1943 (Turusov et al., 2002). In 1974, sufficient evidence was gathered demonstrating that DDT and its metabolites, 2,2-bis(p-chlorophenyl)-1,1-dichloro-ethylene (DDE) and 1,1- dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)-ethane (DDD), were persistent in the environment and showed bioaccumulation in higher animal species causing for instance egg shell thinning and endocrine disruption as a consequence (Thomas et al., 2008). These findings lead to the ban of the production and use in Belgium. DDE toxicity and recalcitrance are therefore regarded as important environmental problems. The hydrophobic character of DDE causes a strong adsorption to soil particulates, making it difficult to remove it from soils. The research of White et al. (2010) has demonstrated that Cucurbita pepo ssp. pepo cultivar Raven (Zucchini Raven) has a strong potential to extract and translocate weathered DDE from soils. The main objective of this research was to improve phytoremediation of DDE-contaminated soils with Cucurbita pepo through the use of plant-associated bacteria and copper nanoparticles. To utilize plant growth-promoting endophytes in phytoremediation applications, it is necessary that they are cultivable in laboratory conditions. Therefore, we investigated different media and gelling agents as well as the effect of the addition of plant extract to the medium on cultivability of endophytic strains. For these purposes, the bacterial communities were identified using both cultivationdependent and cultivation-independent methods and their possible plant growthpromoting capacities were investigated. In our research, a 1/10 diluted rich 869 medium proved to yield the highest numbers of endophytes as well as the highest diversity. Furthermore, we also investigated whether adding plant extract to the bacterial growth medium enhanced the growth of bacteria that were previously stored at -80°C and had lost their ability to grow. The addition of plant extract indeed lead to a significant increase in the growth capacity of bacterial strains that were stored in glycerol. A next step in our research was to evaluate the effects of DDE on both the cultivable and total endophytic communities. We observed an increased endophytic diversity in plants that were exposed to DDE and identified several bacterial strains that could resist DDE toxicity such as Sphingomonas sp. and Stenotrophomonas sp. Recently, copper nanoparticles (CuNPs) are added to pesticides for their antifungal ability as well as their capacity to increase the uptake of pesticides into the plants. Therefore, the effects of CuNPs on plant growth, endophytic communities and DDE uptake were evaluated. Some bacterial strains showed to be sensitive to the combination of DDE and CuNPs, while others showed enhanced presence in the endophytic communities. Ten strains exhibiting both DDE-degrading and plant growth-promoting capacities were selected for a further investigation of their possible application in DDE phytoremediation. Of the 10 strains that were tested, 3 showed a good inoculation efficiency and plant growth-promoting capacity. Therefore, these three strains were selected for a DDE-degradation experiment using GCMS analysis. All three strains demonstrated a good ability to degrade DDE when inoculated in selective 284 medium supplemented with DDE. The genomes of these strains were also fully sequenced which showed them to be Sphingomonas taxi UH1, Methylobacterium radiotolerans UH1 and Enterobacter aerogenes UH1. By analyzing the genomes, several genes involved in plant growth-promotion and DDE-degradation were identified. After investigating the effects of DDE, CuNPs and endophytes separately, the combined effects of these factors on Cucurbita pepo and its DDE-uptake were evaluated. For this experiment, plants were inoculated with S. taxi UH1, M. radiotolerans UH1, E. aerogenes UH1, or a consortium of all three strains before being exposed to CuNPs and DDE. The effects on the plant growth, as well as the changes in DDE-uptake were studied. The presence of CuNPs caused a decrease of plant weight. Inoculation with the selected endophytes however, increased the plant weights to be higher than the non-inoculated control plants. The DDE concentrations of the plants exposed to CuNPs were significantly higher than those of non-exposed plants. The final experiment was to verify if the knowledge that was obtained during all previous experiments in the laboratory could be applied under field conditions. Plants were inoculated with the bacterial strains and grown for 100 days in a DDE-contaminated field. The effects of the inoculation and DDE-contamination were evaluated on both the plants and their endophytic communities (cultivable and total). The results showed a significant increase of the amount of DDE that was extracted from the soil by plants that were inoculated with the consortium of Enterobacter aerogenes UH1, Methylobacterium radiotolerans UH1, and Sphingomonas taxi UH1 in comparison to the non-inoculated control plants. Therefore, we can conclude that the phytoremediation of DDEcontaminated soils with Cucurbita pepo plants can be successfully enhanced through inoculation with DDE-degrading, plant growth promoting endophytes. In laboratory experiments, the presence of CuNPs demonstrated promising results towards increased uptake of DDE, but due to legislative constraints, the effects of CuNPs could not be evaluated in field conditions.

2,2-bis(p-chlorofenyl)-1,1,1-trichloro-ethaan (DDT) werd geproduceerd en toegepast als pesticide vanaf 1939 en het gebruik ervan was tegen 1943 wereldwijd verspreid (Turusov et al., 2002). In 1974 waren er voldoende bewijzen dat DDT en zijn metabolieten, 2,2-bis(p-chlorofenyl)-1,1-dichloroethyleen (DDE) en 1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorofenyl)-ethaan (DDD), zeer persistent waren in het milieu en geaccumuleerd werden in de vetweefsels van hogere diersoorten met verdunning van eierschalen en endocriene verstoring als gevolg (Thomas et al., 2008), wat leidde tot verbieden van zowel het gebruik als de productie van DDT in België. DDE-toxiciteit en persistentie in het milieu worden hierdoor beschouwd als belangrijke milieuproblemen. Het hydrofobe karakter van DDE veroorzaakt een sterke absorptie aan bodempartikels waardoor het moeilijk verwijderbaar is uit de bodem. Het onderzoek van White et al. (2010) toonde het potentieel van Cucurbita pepo ssp. pepo cultivar Raven (Zucchini Raven) om verweerde DDE uit bodems te extraheren en binnen de plant te transporteren aan. De voornaamste doelstelling van dit onderzoek was om fytoremediatie van DDE-vervuilde bodems met Cucurbita pepo te verbeteren door middel van het gebruik van plant-geassocieerde bacteriën en kopernanopartikels (CuNPs). Om plantengroei-bevorderende bacteriën toe te passen in fytoremediatie is het noodzakelijk dat de bacteriën gegroeid kunnen worden in laboratoriumomstandigheden. Daarom werden verschillende media en stollingsmiddelen voor deze media getest, alsook het effect van het toevoegen van plantenextracten aan het bacterieel medium. Tijdens deze experimenten werden de bacteriële gemeenschappen geïdentificeerd door middel van cultivatie-afhankelijke en cultivatie-onafhankelijke methoden en werden hun plantengroei-bevorderende eigenschappen nagegaan. Ons onderzoek toonde aan dat een 1/10 verdund rijk 869 medium zowel de hoogste aantallen bacteriën opleverde, alsook de hoogste diversiteit aan endofyten. Verder werd onderzocht of de toevoeging van plantextract aan het medium kon leiden tot een verbeterde groei van bacteriële stammen waarvan de groeicapaciteit sterk afgenomen of zelfs verloren was na bewaring in een glyceroloplossing bij -80°C. De toevoeging van plantextract leidde inderdaad tot een significante toename van de groeicapaciteit van bacteriën die in een glycerolstock werden bewaard. Een volgende stap in het onderzoek was om de effecten van DDE op zowel de cultiveerbare als de totale endofytische gemeenschappen te evalueren aangezien dit de contaminant is waarop er gefocust werd. We stelden een toename vast van de diversiteit aan endofyten in planten die werden blootgesteld aan DDE en we identificeerden meerdere bacteriële stammen die een hoge tolerantie voor DDE vertoonden, zoals Sphingomonas sp. en Stenotrophomonas sp. Omwille van hun antifungale eigenschappen en om de opname van pesticiden in planten te verhogen worden sedert kort CuNPs toegevoegd aan pesticiden. Daarom hebben we de effecten van CuNPs op de groei van de plant, de endofytische gemeenschappen en de DDE-opname bestudeerd. Sommige bacteriële stammen werden duidelijk geïnhibeerd door de combinatie van DDE en CuNPs, terwijl anderen een verhoogde abundantie vertoonden in de endofytische gemeenschap. Tien bacteriële stammen die zowel DDEdegraderende als plantengroei-bevorderende eigenschappen vertoonden, werden geselecteerd voor verder onderzoek naar hun mogelijke toepassing in de fytoremediatie van DDE. Van de 10 stammen die getest werden, vertoonden er 3 een goede inoculatie-efficiëntie en bevordering van de groei van de planten. Deze 3 stammen werden daarom gekozen voor een DDE-afbraak-experiment gebruik makend van GCMS analyse. De 3 stammen konden DDE afbreken wanneer ze in een selectief 284 medium aangerijkt met DDE geïnoculeerd werden. De volledige genomen van deze stammen werden gesequeneerd. Dit toonde aan dat de stammen tot de soorten Sphingomonas taxi UH1, Methylobacterium radiotolerans UH1 en Enterobacter aerogenes UH1 behoren. Door analyse van de genomen konden verscheidene genen betrokken in de bevordering van de plantengroei en de afbraak van DDE geïdentificeerd worden. Nadat de effecten van DDE, CuNPs en endofyten apart werden bestudeerd, werden ook de gecombineerde effecten van deze factoren geëvalueerd. Tijdens dit experiment werden de planten geïnoculeerd met S. taxi UH1, M. radiotolerans UH1 en E. aerogenes UH1 of een consortium van de 3 stammen voordat ze werden blootgesteld aan CuNPs en DDE. De effecten op de plantengroei en de verschillen in DDE-opname werden geëvalueerd. De aanwezigheid van CuNPs veroorzaakte een afname in het gewicht van de planten. Wanneer de planten echter geïnoculeerd waren met de endofyten, nam het gewicht van de planten toe. In een finaal experiment werd de in het laboratorium vergaarde kennis getest onder veldcondities. Planten werden geïnoculeerd met de geselecteerde endofyten en gedurende 100 dagen gegroeid in een met DDE vervuild veld. De effecten van de inoculatie en de blootstelling aan DDE-vervuiling werden bestudeerd zowel op de groei van de planten als op de cultiveerbare en totale endofytische gemeenschappen. De resultaten toonden een significante toename in de hoeveelheid DDE die verwijderd werd uit de bodem door de planten geïnoculeerd met het consortium van Enterobacter aerogenes UH1, Sphingomonas taxi UH1 en Methylobacterium radiotolerans UH1 in vergelijking met de niet-geïnoculeerde controleplanten. We kunnen daardoor besluiten dat fytoremediatie van DDE-vervuilde bodem met Cucurbita pepo planten succesvol verbeterd kan worden door de inoculatie van planten met DDE-degraderende, plantengroei-bevorderende endofyten. Ook de toepassing van CuNPs toonde onder laboratoriumomstandigheden beloftevolle resultaten voor het verbeteren van fytoremediatie van DDE, maar dit kon door wettelijke beperkingen niet geëvalueerd worden onder veldcondities.