Human dental pulp stem cell-mediated mechanisms of neuroregeneration and optimization of the transient middle cerebral artery occlusion mouse stroke model

Abstract

Worldwide, stroke is the second most common cause of death, accounting for 10-15% of deaths each year. Moreover, stroke is an important cause of adult disability as 90% of patients that survive from a stroke are left with a residual deficit. In addition, the highest incidence of these pathologies is observed in the elderly, increasing the socioeconomic burden in an aging population. In ischemic stroke, the blood supply to certain brain areas is compromised which triggers a cascade of deleterious events ultimately leading to neuronal cell death. The resulting severe neurological dysfunction clinically translates into paralysis, sensory disturbances, aphasia, urinary incontinence and cognitive impairment. Limited stroke-induced endogenous neurogenesis can be observed in patients but adequate functional recovery is not achieved. Recombinant tissue plasminogen activator is the only FDA-approved pharmacological treatment for ischemic stroke and has to be administered within 4.5 hours after the ischemic insult, limiting its use to 2-4% of the patients and is unable to sufficiently improve the functional outcome. These indications highlight the urgent need for improved treatment of stroke patients. Stem cell therapy is a promising approach to minimize neurological damage and enhance functional recovery after stroke. The ideal source of stem cells for ischemic stroke would be neural stem cells (NSCs) or neural precursor cells (NPCS), but due to practical and ethical considerations, a stem cell source that is able to reconstitute the tissue or stimulate endogenous repair is needed. This thesis evaluated the neuroregenerative potential of human dental pulp stem cells (hDPSCs), a subtype of mesenchymal stem cells that can easily be isolated from extracted third molars with low invasiveness. Multiple mechanisms of action of stem cell-based therapies for ischemic stroke have been suggested. These include differentiation towards neuronal cells and integration in the host tissue, but more likely, paracrine-mediated mechanisms are responsible for stem cell-induced functional recovery after transplantation into animal stroke models. Therefore, the neuronal differentiation potential of hDPSCs was investigated and the paracrine actions of the hDPSC secretome were assessed. Before exploring the mechanisms of hDPSC-induced neuroregeneration, the optimal isolation method for these stem cells was determined (Chapter 2). Two commonly used isolation methods, the enzymatic digestion and outgrowth method, were used to isolate hDPSCs and the stem cell properties and multilineage differentiation potential was investigated. Both isolation methods could be used to obtain an hDPSC population for downstream applications as no influence of isolation methodology on the stem cell properties and multilineage differentiation potential of hDPSCs was observed. Next, the ability of hDPSCs to differentiate towards neuronal cells was investigated (Chapter 3). The results in this chapter showed that hDPSCs are able to differentiate into cells with functional and immunocytochemical properties of immature neurons albeit with a low success rate. In addition to the potential of hDPSCs to differentiate into neuronal cells, the capacity of the hDPSC secretome to stimulate neuroregenerative mechanisms was evaluated. The commonly used SH-SY5Y neuroblastoma cell line which is known to possess NPC characteristics was used to determine the potential of the hDPSCs secretome to stimulate migration, proliferation, neurite outgrowth and neuronal differentiation of SH-SY5Y cells (Chapter 4). With the exception of SHSY5Y proliferation, these important neuroregenerative mechanisms were stimulated by the hDPSC secretome. Moreover, this in vitro experimental design showed that the widely used SH-SY5Y cell line can improve and simplify the preclinical in vitro research on the molecular mechanisms of stem cell-mediated neuronal regeneration. Although these data were encouraging and showed the in vitro potential of SH-SY5Y cells, these immortalised tumour cells are by definition not NSCs or NPCs. Therefore, the influence of the hDPSC secretome was also evaluated on NSCs and primary cortical neurons (Chapter 5). Moreover, as efforts are being made to prepare or ‘prime’ stem cells for the microenvironment they are to be transplanted in prior to transplantation which aims to alter and/or enhance the growth factor content of the stem cell-derived secretome, we used a novel priming approach by exposing hDPSCs to key components of the inflammatory reaction which can be found in the blood. To achieve this priming process, we evaluated whether a clinically successfully applied, blood-derived biomaterial, leukocyte- and platelet rich fibrin (L-PRF), can enhance the neuroregenerative effect of hDPSCs by altering their secretome. The results in this chapter demonstrated that the hDPSC secretome protects primary cortical neurons against ischemic death and was capable to enhance neuritogenesis in these cells. Moreover, the secretome had a chemoattractant effect on NSCs but did not stimulate NSC proliferation. Unfortunately no additional effect on the paracrine-mediated mechanisms of regeneration described in this study were observed when hDPSCs were primed with L-PRF. Finally, the transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) mouse stroke model was optimized together with a battery of behavioural tests that can distinguish stroke-related symptoms up to one month. In addition, a pilot study using intravenous delivered hDPSCs to evaluate functional improvement after transplantation was conducted (Chapter 6). Although the mouse stroke model was successfully optimized and implemented, no effect of the hDPSC transplantation on functional improvement was observed. The results from the in vivo pilot indicated unsuccessful induction of tMCAO in the experimental cohort as shown by magnetic resonance imaging and loss of bioluminescent signal from the transplanted cells within 72 hours after transplantation. Therefore, no effect of the hDPSC transplantation on stroke outcome could be evaluated. These findings stress the need of establishing standard operation procedures and early lesion verification to obtain standardized stroke lesions with reproducible deficits for this model to be implemented. Nonetheless, the work in this thesis paves the way for preclinical studies that focus on hDPSC-based stem cell therapies for ischemic stroke. Future studies should aim to establish longitudinal follow-up with non-invasive imaging methods in order to allow donor cell-fate and changes in host microenvironment to be linked with behavioural and functional improvements which can lead to additional insight in the mechanisms responsible for functional recovery in stroke after donor cell transplantation.

Het herseninfarct is wereldwijd de tweede meest voorkomende doodsoorzaak waarbij 10-15% van de overlijdens jaarlijks hieraan te wijten zijn. Daarenboven blijft 90% van de patiënten die het infarct overleven achter met een permanente handicap. Aangezien de hoogste incidentie in herseninfarcten wordt waargenomen bij ouderen, leidt dit tot een verhoogde socio-economische last in een vergrijzende populatie. In het ischemisch herseninfarct is de bloedsvoorziening naar bepaalde hersengebieden verstoord welke een cascade van schadelijke effecten veroorzaakt die uiteindelijk voor neuronale celdood zorgen. De daaropvolgende ernstige afwijking in neurologische functie vertaalt zich klinisch in paralyse, sensorische uitval, afasie, urinaire incontinentie en cognitieve problemen. Het endogeen herstel na een herseninfarct is beperkt waardoor er geen functioneel herstel meer kan optreden. Recombinant weefsel plasminogeen activator is momenteel de enige FDA goedgekeurde farmacologische behandeling voor het ischemisch herseninfarct en dit dient binnen de 4.5 uur na de start van de ischemie te worden toegediend. Hierdoor kan dit geneesmiddel slechts bij 2-4% van de patiënten gebruikt worden en is er sprake van onvoldoende functioneel herstel. Deze indicaties tonen de dringende nood aan voor een betere behandeling voor patiënten met een herseninfarct. Stamceltherapie is een veelbelovende aanpak om neurologische schade te beperken en om functioneel herstel na het herseninfarct te stimuleren. De ideale stamcelbron voor het ischemisch herseninfarct zouden neurale stamcellen (NSCs) of neurale precursorcellen (NPCs) zijn, maar wegens praktische en ethische overwegingen is er nood aan een alternatieve stamcelbron die in staat is het verloren weefsel te vervangen of endogeen herstel te stimuleren. In dit doctoraatsproefschrift werd het neuroregeneratief potentieel onderzocht van humane dentale pulpastamcellen (hDPSCs), een subtype van mesenchymale stamcellen dat eenvoudig en niet-invasief uit geëxtraheerde wijsheidstanden kan worden geïsoleerd. Het therapeutische effect van stamcelgebaseerde therapieën wordt aan meerdere mechanismen gekoppeld. Hierbij werd verondersteld dat dit te wijten was aan differentiatie van de stamcellen naar neuronale cellen en de integratie in het gastheerweefsel, maar waarschijnlijk zijn vooral de paracriene mechanismen verantwoordelijk voor stemcel-geïnduceerd functioneel herstel. Daarom werden in deze studie zowel het neuronaal differentiatiepotentieel van hDPSCs als de paracriene effecten van het hDPSC secretoom onderzocht. Vooraleer de mechanismen van hDPSC-geïnduceerde neuroregeneratie werden onderzocht, werd de optimale isolatiemethode voor hDPSCs bepaald (Hoofdstuk 2). Hiervoor werden twee vaak gebruikte methoden, de enzymatische digestie- en uitgroei methode, gebruikt om hDPSCs te isoleren uit wijsheidstanden. Nadien werden de stamceleigenschappen en het typische differentiatiepatroon van de cellen bepaald. Zo werd duidelijk dat beide isolatiemethoden gebruikt kunnen worden om hDPSCs te isoleren voor verdere toepassingen aangezien de isolatiemethode geen invloed had op de stamceleigenschappen van hDPSCs of op hun differentiatiepotentieel naar meerdere celtypes. Hierna werd het vermogen van hDPSCs om naar neuronale cellen te differentiëren onderzocht (Hoofdstuk 3). De resultaten in dit hoofdstuk toonden aan dat hDPSCs kunnen differentiëren tot cellen met functionele en immunocytochemische eigenschappen van immature neuronen maar met een lage succesratio. Naast het neuronale differentiatiepotentieel van hDPSCs, werd de capaciteit van het hDPSC secretoom om neuroregeneratieve mechanismen te stimuleren, geëvalueerd. De vaak gebruikte SH-SY5Y neuroblastoma cellijn waarvan geweten is dat deze NPC karakteristieken vertoont, werd hierbij gebruikt om het potentieel van het hDPSC secretoom op migratie, proliferatie, neurietuitgroei en neuronale differentiatie van SH-SY5Y cellen te onderzoeken (Hoofdstuk 4). Met uitzondering van SH-SY5Y proliferatie, werden deze neuroregeneratieve mechanismen gestimuleerd door het hDPSC secretoom. Daarenboven toont deze deze studie gebruikten wij een nieuwe priming aanpak door hDPSCs bloot te stellen aan componenten van de ontstekingsreactie die teruggevonden kunnen worden in bloed. Om dit primingsproces te optimaliseren, evalueerden we of een klinisch succesvol toegepast biomateriaal dat wordt afgeleid uit het bloed, ”leukocyt- en plaatjes-rijk fibrine“ (L-PRF), het neuroregeneratief effect van hDPSCs kan verbeteren door hun secretoom aan te passen. De resultaten in dit hoofdstuk toonden aan dat het hDPSC secretoom primaire corticale neuronen beschermt tegen ischemische celdood en ook de neuritogenese in deze cellen werd bevorderd. Daarenboven had het hDPSC secretoom een chemoattractief effect op NSCs, maar werd NSC proliferatie niet gestimuleerd. Helaas werd er geen additioneel effect waargenomen op de beschreven paracrien-gemedieerde mechanismen van neuroregeneratie wanneer hDPSCs werden geprimed met LPRF. Als laatste werd het transient a. cerebri media occlusie (tMCAO) muismodel voor het ischemisch herseninfarct geoptimaliseerd samen met een reeks gedragstesten die infarctgerelateerde symptomen tot één maand kunnen onderscheiden. Daarenboven werd een pilootstudie uitgevoerd waarbij hDPSCs intraveneus werden toegediend om functioneel herstel na transplantatie te beoordelen (Hoofdstuk 6). Ondanks dat het tMCAO model succesvol kon worden geoptimaliseerd en geïmplementeerd, kon geen effect van de getransplanteerde hDPSCs op functioneel herstel worden geobserveerd. De resultaten van de in vivo pilootstudie toonden via magnetische resonantie beeldvorming aan dat het infarct onsuccesvol werd geïnduceerd en dat de stamcellen niet meer gedetecteerd konden worden met bioluminescentiebeeldvorming 72 uur na de transplantatie. Daarom kon er geen effect van de hDPSC transplantatie op de infarctuitkomst worden geëvalueerd. Deze bevindingen tonen de nood aan om een gestandaardiseerd operatieprotocol te hanteren en vlak na de operatie de laesie te verifiëren om gestandaardiseerde infarctleaesies te verkrijgen met reproduceerbare functionele tekortkomingen om dit model te kunnen implementeren. Desalniettemin effent het werk in dit doctoraatsproefschrift de weg naar preklinische studies die zich toespitsen op het gebruikt van hDPSC-gebaseerde stamceltherapieën voor het ischemisch herseninfarct. Vervolgstudies dienen zich in vitro experimentele opzet aan dat de SH-SY5Y cellijn het preklinisch in vitro onderzoek naar de moleculaire mechanismen van stamcelgemedieerde neuronale regeneratie kan verbeteren en versimpelen. Ondanks de bemoedigende in vitro resultaten van de SH-SY5Y cellen, moet opgemerkt worden dat deze geïmmortaliseerde tumorcellen per definitie geen NSCs/NPCs zijn. Daarom werd de invloed van het hDPSC secretoom ook geëvalueerd op NSCs en primaire corticale neuronen (Hoofdstuk 5). Momenteel worden pogingen ondernomen om stamcellen voor te bereiden of te ‘primen’ voor de micro-omgeving waarin ze getransplanteerd zullen worden met als doel het stamcelsecretoom aan te passen of de inhoud aan groeifactoren te verrijken. In deze studie gebruikten wij een nieuwe priming aanpak door hDPSCs bloot te stellen aan componenten van de ontstekingsreactie die teruggevonden kunnen worden in bloed. Om dit primingsproces te optimaliseren, evalueerden we of een klinisch succesvol toegepast biomateriaal dat wordt afgeleid uit het bloed, ”leukocyt- en plaatjes-rijk fibrine“ (L-PRF), het neuroregeneratief effect van hDPSCs kan verbeteren door hun secretoom aan te passen. De resultaten in dit hoofdstuk toonden aan dat het hDPSC secretoom primaire corticale neuronen beschermt tegen ischemische celdood en ook de neuritogenese in deze cellen werd bevorderd. Daarenboven had het hDPSC secretoom een chemoattractief effect op NSCs, maar werd NSC proliferatie niet gestimuleerd. Helaas werd er geen additioneel effect waargenomen op de beschreven paracrien-gemedieerde mechanismen van neuroregeneratie wanneer hDPSCs werden geprimed met LPRF. Als laatste werd het transient a. cerebri media occlusie (tMCAO) muismodel voor het ischemisch herseninfarct geoptimaliseerd samen met een reeks gedragstesten die infarctgerelateerde symptomen tot één maand kunnen onderscheiden. Daarenboven werd een pilootstudie uitgevoerd waarbij hDPSCs intraveneus werden toegediend om functioneel herstel na transplantatie te beoordelen (Hoofdstuk 6). Ondanks dat het tMCAO model succesvol kon worden geoptimaliseerd en geïmplementeerd, kon geen effect van de getransplanteerde hDPSCs op functioneel herstel worden geobserveerd. De resultaten van de in vivo pilootstudie toonden via magnetische resonantie beeldvorming aan dat het infarct onsuccesvol werd geïnduceerd en dat de stamcellen niet meer gedetecteerd konden worden met bioluminescentiebeeldvorming 72 uur na de transplantatie. Daarom kon er geen effect van de hDPSC transplantatie op de infarctuitkomst worden geëvalueerd. Deze bevindingen tonen de nood aan om een gestandaardiseerd operatieprotocol te hanteren en vlak na de operatie de laesie te verifiëren om gestandaardiseerde infarctleaesies te verkrijgen met reproduceerbare functionele tekortkomingen om dit model te kunnen implementeren. Desalniettemin effent het werk in dit doctoraatsproefschrift de weg naar preklinische studies die zich toespitsen op het gebruikt van hDPSC-gebaseerde stamceltherapieën voor het ischemisch herseninfarct. Vervolgstudies dienen zich te richten op het gebruik van niet-invasieve beeldvormingsmethoden om het lot van de donorcellen en veranderingen in de micro-omgeving van de gastheer te kunnen correleren met gedrags- en functioneel herstel. Deze kunnen leiden tot nieuwe inzichten in de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor functioneel herstel in het herseninfarct na transplantatie van de donorcellen.