Molecularly imprinted polymer based sensors for bio-sensing applications.

Abstract

Gebruiksvriendelijke en goedkope sensoren die een biologisch relevant doelmolecule in zijn fysiologische concentraties kunnen detecteren en kwantificeren op een consistente en accurate manier, zijn zeer interessant voor toepassingen in de medische diagnostiek en voedsel- en omgevingsveiligheid. Vandaag de dag wordt de concentratie van een doelmolecule in een staal doorgaans bepaald in gespecialiseerde laboratoria door gespecialiseerd personeel dat gebruik maakt van dure en tijd consumerende detectietechnieken zoals immunoassays, vloeistof- en gaschromatografie. Bijgevolg, richten vele onderzoekers zich op de ontwikkeling van een gebruiksvriendelijke, goedkope en betrouwbare diagnostische sensor die buiten het laboratorium kan gebruikt worden als alternatief. Biosensoren gebruiken biologische receptoren als detectie element omdat deze zeer specifiek en selectief zijn tijdens het binden van het doelmolecule. Biologische receptoren hebben echter ook grote nadelen betreffende de kostprijs en de stabiliteit. Daarnaast zijn er veel doelmoleculen waarvoor er geen stabiele biologische receptoren bestaan. In dit opzicht zouden synthetische moleculair geïmprinte polymeren (MIPs) een interessant alternatief zijn aangezien ze voordelen bieden op gebied van stabiliteit en kostprijs terwijl ze toch nog voldoende affiniteit en selectiviteit voor het doelmolecule tonen. MIPs worden gemaakt door het polymeriseren van functionele en crosslinkende monomeren in de aanwezigheid van het sjabloon doelmolecule. Na het polymeriseren en het verwijderen van de sjabloon doelmoleculen, blijft er een afdruk in het polymeer over dat complementair is aan het doelmolecule betreffende de grootte, de vorm en de functionele groepen. Bij gevolg kunnen deze afdrukken, ook wel imprints genoemd, het doelmolecule met een hoge affiniteit en specificiteit binden. Niet geïmprinte polymeren (NIPs) worden als negatieve controle gebruikt. MIP gebaseerde sensoren werden eerder al ontwikkeld in het Instituut voor Materiaalonderzoek voor de detectie van verschillende doelmoleculen en werden vervolgens continu geoptimaliseerd om hun prestatie, betrouwbaarheid en herbruikbaarheid te verbeteren. Aan het begin van mijn doctoraat, waren bulk MIP gebaseerde sensoren voor de detectie van nicotine, histamine, cafeïne en serotonine reeds ontwikkeld. Hierbij werd er gebruik gemaakt van stempelen en een polymeer lijm als afzet en immobilisatie techniek, respectievelijk. Impedantie spectroscopie, de heattransfer methode (HTM) en de kwarts kristal microbalans werden hierbij gebruikt als uitleestechnieken. Echter, wanneer bulk polymerisatie gebruikt wordt als synthese techniek om MIPs te maken, verkrijgt men partikels met een onregelmatige vorm, een brede grootte verdeling (0.1 – 50 µm) en een relatief klein detectieoppervlak. Omwille van deze redenen zijn de toepassingsmogelijkheden van bulk MIPs voor commercieel verkrijgbare diagnostische sensoren eerder gelimiteerd. De stempel techniek werd gebruikt om de MIP partikels op het sensor substraat af te zetten. Deze techniek is tijd consumerend en zeer afhankelijk van de kunde van de operator wat leidt tot grote variaties in en tussen verschillende sensor substraten betreffende de hoeveelheid en de verdeling van de MIP partikels. Bijkomend is het mogelijk dat de polymere lijmlaag die gebruikt werd om de MIP partikels te immobiliseren, verschillende imprints fysiek zal blokkeren en los kan komen tijdens de sensor meting. Dit kan leiden tot een verlaagde sensor gevoeligheid en onvoorziene foutieve detectie van het doelmolecule en limiteert de mogelijkheden voor herbruikbare sensoren. In deze thesis, focust elk hoofdstuk zich op verschillende efficiënte en eenvoudige strategieën om de voorgenoemde problemen te omzeilen. Aangezien het zeer interessant is om een goedkope, hoog performante, reproduceerbare en herbruikbare sensor te ontwikkelen voor de detectie van (bio-) moleculen in biologische stalen in fysiologische concentraties, werd elk hoofdstuk in deze thesis gewijd aan het realiseren van één of meerdere van deze eigenschappen. De belangrijkste resultaten en toekomst perspectieven in dit werk werden hieronder volgens hoofdstuk samengevat. Tijdens het eerste deel van mijn doctoraat (hoofdstuk 2), werd de focus gelegd op het ontwikkelen van MIP partikels met een verbeterde herkenning van het doelmolecule doordat ze aan de ene kant homogeen waren in grootte, vorm en materiaal verdeling en aan de andere kant een verhoogd detectie oppervlak vertoonden door hun kleine sub-micron diameter. Om dit doel te bereiken, werden er twee strategieën gecombineerd. De eerste strategie was de implementatie van de veelzijdige miniemulsie techniek om colloïde MIP partikels in de vorm van water gebaseerde dispersies te maken. De bekomen colloïde MIP partikels vertoonden een kleinere diameter (± 500 nm), een sferische vorm en een relatief kleine grootte verdeling. Vervolgens, om nog een stap verder te gaan en ook controle te krijgen over de homogeniteit van de materiaalverdeling binnenin de MIP partikels, werd een tweede strategie gebruikt. Doorgaans worden MIPs verkregen door het combineren van een crosslinkend monomeer (± 80 – 90 %) met een functioneel monomeer (± 10 – 20 %) dat groepen bevat die kunnen interageren met de doelmoleculen. Om een homogene verdeling van het crosslinkend en functioneel monomeer te verzekeren in het polymeer netwerk, moeten deze twee structureel gelijkend zijn. Daarom moet men een geschikt functioneel monomeer kiezen afhankelijk van het doelmolecule en de crosslinker. Daarenboven hangt de kwaliteit van de MIP ook nog eens af van de onderlinge concentratie ratio’s van de individuele componenten. Als alternatief, werd er in deze thesis een al eerder ontwikkeld bifunctioneel crosslinked monomeer: N,O-bismethacryloyl ethanolamine (NOBE) gebruikt. Met dit concept werd er een eenvoudigere route ontwikkeld om colloïde MIP partikels te maken waarbij de nood aan bijkomstige functionele monomeren en de optimalisatie van de relatieve ratio’s van functionele en crosslinkende monomeren en doelmoleculen omzeild werd. NOBE bulk en miniemulsie MIPs geïmprint met testosteron werden succesvol gesynthetiseerd. Om te bewijzen dat de colloïde MIPs wel degelijk superieur zijn aan de conventionele bulk MIPs, werd er een vergelijkende studie uitgevoerd. Dit was mogelijk doordat zowel de bulk als de miniemulsie NOBE MIPs met dezelfde relatieve ratio’s van doelmolecule, monomeer, initiator en porogeen samengesteld werden. De moleculaire herkenningscapaciteit van de twee verschillende soorten MIPs werd bestudeerd aan de hand van evenwicht bindingsanalyses in een waterige oplossing. Eerst, werden de bindingseigenschappen van de bulk MIP en NIP partikels getest bij verschillende pH waarden. Na het selecteren van de meest optimale pH, werden de evenwicht bindingsanalyse studies ook uitgevoerd met het miniemulsie MIP-NIP duo. Deze experimenten gaven aan dat de colloïde NIPs significant minder aspecifieke binding vertoonden in vergelijking met de bulk NIPs. De colloïde MIPs vertonen significant meer voordelen die ze te danken hadden aan hun kleine omvang, homogeniteit en vergroot oppervlak wat resulteert in toegenomen imprintfactoren (6.8 vs 2.2) en een verbeterde selectiviteit in vergelijking met bulk MIPs. Ten slotte, werden zowel de bulk als de miniemulsie partikels getest op hun selectiviteit met verschillende moleculen die structureel gelijken op het doelmolecule testosteron, namelijk methyl testosteron, β-estradiol en estriol. Deze experimenten toonden aan dat de herkenning van de structurele analoge moleculen sterk afhankelijk is van de mate waarop ze gelijken op het doelmolecule. In het kort, in dit hoofdstuk werden voor de eerste keer colloïde MIPs, die testosteron en zijn structureel gelijkende moleculen herkennen, ontwikkeld via een vereenvoudigd synthese protocol dat gebaseerd is op een bifunctioneel monomeer in een waterige oplossing. In de toekomst kan het miniemulsie MIP synthese recept afgesteld worden om partikels met een nog lagere polydispersiteit te verkrijgen. Om dit te bereiken kan er een co-stabilisator toegevoegd worden aan het systeem. Er moet echter wel rekening gehouden worden met de mogelijkheid dat deze laatste component de binding tussen het monomeer en het doelmolecule zou kunnen beïnvloeden. 2-methyl-N-(3-methyl2-oxobut-3-enyl)acrylamide (NAG) is een ander bifunctioneel monomeer dat getest zou kunnen worden om nog beter werkende MIPs te verkrijgen. NAG zou de resolutie van de afdruk van het doelmolecule kunnen verbeteren aangezien deze crosslinker korter is in vergelijking met NOBE. Andere monomeren die verschillende functionaliteiten bevatten kunnen gebruikt worden om doelmoleculen met complementaire functionele groepen te imprinten. Wanneer de niet-covalente imprint methode wordt toegepast, kan men niet enkel gebruik maken van waterstofbindingen tussen het functioneel monomeer en het doelmolecule, maar ook van electrostatische, hydrofobe, etc. interacties. Na het verkrijgen van deze superieure miniemulsie MIPs, ging onze focus naar hun integratie in een sensor toepassing (hoofdstuk 3). Er zijn twee veelgebruikte manieren om MIPs op een sensor substraat te immobiliseren. De eerste manier maakt gebruik van een polymere adhesielaag (zoals een lijm) en de tweede manier is via chemische koppeling. Aangezien een adhesie polymeer een deel van de MIP imprints blokkeert (wat leidt tot een afgenomen sensor sensitiviteit) en zou kunnen los komen tijdens de meting (wat leidt tot een foutieve doelmolecule kwantificatie), ging in dit werk de voorkeur naar een directe chemische koppeling op het sensor oppervlak. Een gedopeerd silicium substraat bedekt met een gedopeerd nanokristallijn diamant laagje werd gefunctionaliseerd met amorfe koolstoflaag via evaporatie. Vervolgens werden de miniemulsie partikels aan de hand van hun vinyl oppervlakte groepen covalent gekoppeld aan de koolsoflaag door middel van UV licht. Door deze directe koppeling worden er geen imprints geblokkeerd en worden de preparatie stappen gereduceerd terwijl er toch nog steeds een sterke en betrouwbare binding verkregen wordt. In vergelijking met het gebruik van linker moleculen zoals silanen om de MIP partikels te immobiliseren, laat de directe koppeling een veel kortere afstand tussen het substraat en de receptor toe wat cruciaal is voor oppervlakte gevoelige detectietechnieken. Na het verwijderen van de niet gebonden MIP partikels, tonen de rasterelektronenmicroscoop (SEM) afbeeldingen dat de MIP partikels uniform verdeeld zijn over het sensor oppervlak. Om te testen in welke mate de MIP sensor substraten het doelmolecule selectief kunnen detecteren in biologische stalen, werden testosteron en β-estradiol in bepaalde concentraties in zowel buffer als urine stalen opgelost. Elektrochemische impedantie spectroscopie (EIS) werd hier als uitleestechniek gebruikt. Deze sensor metingen toonden aan dat testosteron selectief en in fysiologische nM concentraties gedetecteerd kon worden in zowel buffer als urine stalen. In het kort, de MIP immobilisatie methode die gebruikt werd in dit hoofdstuk is eenvoudig, vereist een minimaal aantal preparatie stappen en omzeilt het gebruik van een polymere adhesielaag. Om het actieve detectie oppervlak van de sensor te vergroten, zullen naar de toekomst toe optimalisaties gedaan worden. Aan de ene kant zullen de MIP partikels kleiner gemaakt worden en aan de andere kant zal de sensor bedekking met MIP deeltjes verbeterd worden. Ook de sensor flow-cell opstelling kan geoptimaliseerd en geminiaturiseerd worden om lagere detectielimieten en snellere responstijden te verkrijgen. Een andere interessante strategie om een betrouwbare hoog performante sensor te verkrijgen, is de in situ polymerisatie en hechting van gepatroneerde MIP structuren met specifieke geometrieën direct op het sensor substraat via microfluidische systemen (hoofdstuk 4). Een hoofdstructuur die een specifiek patroon bevat om het uiteindelijke detectie oppervlak te maximaliseren, werd gemaakt met behulp van elektronen straal lithografie. Van deze hoofdstructuur werd vervolgens een afdruk, gebaseerd op het elastische polydimethylsiloxaan, gegoten. Deze vorm werd dan geplaatst op een diamant silicium substraat dat gefunctionaliseerd werd met een laagje amorfe koolstof. De structuren werden gevuld met een prepolymerisatie mix bestaande uit testosteron en NOBE (monomeer). Daarna werden de in situ polymerisatie en koppeling aan het substraat gestart door middel van UV-licht. Deze simpele en kosten efficiënte techniek laat aan de ene kant een stevigere immobilisatie en aan de andere kant een controleerbare, homogene en reproduceerbare receptor materiaal verdeling op de sensor toe. De methode die hier werd gebruikt reduceert het aantal preparatie stappen aangezien verschillende elastische vormen gemaakt kunnen worden van één hoofdstructuur. Dit betekent dat de dure en tijd consumerende elektronen straal lithografie stap maar één keer doorlopen moet worden. Na het verwijderen van de elastische vorm en de sjabloon doelmoleculen, werd de selectieve detectie van de sensor substraten getest in buffer, urine en speeksel waar testosteron, β-estradiol of estriol in opgelost werd. Tijdens deze testen werd EIS als uitleestechniek gebruikt. Er werd een differentiële flow-cell sensor opstelling ontwikkeld waarin zowel de MIP als de NIP substraten tegelijk getest kunnen worden in dezelfde vloeistof omgeving. Met dit concept wordt het effect van de omgevingsfactoren en staal variaties (complexe samenstellingen) op het signaal geëlimineerd. De sensormetingen toonden aan dat de MIP structuren inderdaad testosteron konden binden op een selectieve manier zowel in buffer als in biologische stalen. Zelfs het staal dat de laagste concentratie testosteron bevatte (0.5 nM), zorgde voor een meetbare stijging in het sensor signaal. Hoewel de sensor respons gemeten in de urine stalen vergelijkbaar is met de respons gemeten in buffer stalen, zorgden de speeksel stalen voor een verlaagd, maar toch nog significant signaal. Dit kan te wijten zijn aan het feit dat speeksel veel meer eiwitten en andere moleculen bevat in vergelijking met urine. Deze eiwitten kunnen een aanzienlijke hoeveelheid imprints blokkeren wat resulteert in een afgenomen sensor gevoeligheid. Na de sensor metingen waarin de MIP structuren onderhevig gesteld werden aan een dynamische vloeistof omgeving, werd aan de hand van optische microscopie vastgesteld dat de structuren nog steeds intact waren. Doordat de MIP een groot oppervlak heeft en stevig gebonden is aan het substraat, wordt regeneratie van de sensor mogelijk aan de hand van een aantal wasstappen. Vervolgens werd er een tweede sensormeting uitgevoerd die wederom een concentratie afhankelijke signaal stijging aangaf bij het toevoegen van testosteron. In het kort, een kostenefficiënte en eenvoudige techniek voor het ontwikkelen van gevoelige, hoog performante, reproduceerbare en gestructureerde MIP sensoren voor het elektronisch detecteren van (bio-) moleculen werd in dit werk voorgesteld. Deze techniek biedt genoeg flexibiliteit om de geometrieën van de MIPs aan te passen door het ontwikkelen van een gepaste hoofdstructuur. Als een volgende stap, om nog lagere doelmolecule concentraties (pM) te kunnen detecteren, kan langs de ene kant de meetopstelling aangepast en geminiaturiseerd worden en langs de andere kant een groter actief detectie oppervlak ontwikkeld worden. Een groter actief detectie oppervlak zal ook kortere sensor regeneratietijden toelaten. Additioneel kunnen MIP structuren die geïmprint zijn met verschillende doelmoleculen langs elkaar op één sensor substraat geïmmobiliseerd worden. Dit concept laat toe om verschillende doelmoleculen in een staal gelijktijdig te detecteren in één sensormeting. In hoofdstuk 5, werd er een nieuwe MIP afzettechniek in combinatie met een goedkoper MIP immobilisatie adhesie materiaal verkend met het oog op kostenefficiënte en schaalbare sensoren. Bulk MIP partikels (0.1 – 10 µm) die geïmprint zijn met serotonine, werden succesvol getest op hun vermogen om het doelmolecule te binden via evenwicht bindingsanalyses. Vervolgens werden de MIP partikels geïmmobiliseerd op een vlakke aluminium electrode via een adhesielaag. Hiervoor werd het duur geconjugeerd polymeer namelijk poly[2- methoxy-5-(3’,7’-dimethoxyoctyloxy)-1,4-phenylenevinylene] (MDMO-PPV) die in de voorgaande sensoren gebruikt werd vervangen door het goedkoper en meer toegankelijk polymeer polyvinylchloride (PVC). Een PVC oplossing werd bovenop het aluminium substraat gespincoat zodat er een laag van 180 nm bekomen werd. Ook de stempel techniek die in de voorgaande sensoren gebruikt werd om de MIP partikels af te zetten, werd vervangen door de spraycoat techniek. Dit werd gedaan omdat het resultaat van het stempelen zeer afhankelijk is van de kunde van de operator terwijl het spraycoaten reproduceerbaar is, geautomatiseerd kan worden en kan gebruikt worden bij sensor fabricatie op grote schaal. Na het afzetten van de MIP en NIP partikels, werden de substraten verwarmd tot net boven de glas transitie temperatuur van PVC. Op deze manier werd de adhesielaag zacht en konden de partikels er deels in zinken waardoor ze vast kwamen te zitten. Om de twee verschillende MIP afzettechnieken te vergelijken op vlak van oppervlakte bedekking, werden zowel de gestempelde als de gespraycoatte sensorsubstraten vergeleken op basis van optische microscopie en rasterelektronenmicroscopie. Met spraycoaten kan men grote hoeveelheden MIP partikels op het substraat afzetten door het aantal spraycoat passages aan te passen. Langs de ene kant bevatten de gespraycoate substraten een hogere hoeveelheid en een homogenere verdeling van het MIP materiaal op het oppervlak in vergelijking met de gestempelde substraten. Langs de andere kant werden bij het stempelen de polymeer partikels mechanisch op het sensor substraat geduwd waardoor ze dieper in de PVC laag kwamen te zitten. Dit effect werd bevestigd aan de hand van rasterelektronenmicroscoop beelden van de doorsnede van het substraat. Voor de gespraycoate stalen toonden deze beelden echter aan dat de MIP partikels nauwelijks in de PVC laag verzonken waren. Om de sensor perfomantie te testen, werd de kostenefficiënte en eenvoudige heat transfer methode (HTM) gebruikt als uitleestechniek. De HTM omzeilt de nood aan een gesofisticeerde opstelling aangezien het maar twee thermokoppels, een PID (proportioneel, integrerend en differentiërend) regelaar en een aanpasbare warmte bron vereist. Deze experimenten toonden aan dat de sensorrespons voor beide afzettechnieken in dezelfde range lag. Echter, de gestempelde sensor gaf 10 % meer respons en minder saturatie bij een doelmolecule concentratie van 500 nM in vergelijking met de gespraycoate sensor. Dit resultaat bewijst dat de performantie van de sensor meer beïnvloed werd door de manier waarop de MIP partikels ingebed zaten in de adhesielaag en dus ook hoe kort ze tegen het aluminium substraat aan zaten in vergelijking met de hoeveelheid MIP partikels die op het substraat zaten. Hoewel de gespraycoate sensor performantie nog niet optimaal is, heeft deze afzettechniek duidelijke voordelen inzake automatisatie en schaalbaarheid. De combinatie van het goedkope PVC, de schaalbare en reproduceerbare afzettechniek en de miniaturiseerbare uitleesmethode, laat de ontwikkeling van een kosten efficiënte sensor toe om (bio-) moleculen met een laag moleculair gewicht te detecteren. Als een volgende stap, kunnen de spraycoat condities (zoals bijvoorbeeld de hoeveelheid MIP partikels per substraat) en de dikte van de PVC laag geoptimaliseerd worden met het oog op het bekomen van een grotere sensor respons. Om een beter contact te krijgen tussen de gespraycoate MIP partikels en het sensor substraat, kan men bijvoorbeeld de gesprayde partikels nog eens mechanisch in de PVC laag duwen zodat ze dieper komen te zitten. Lagere detectielimieten en snellere responstijden kunnen verkregen worden door optimalisatie en miniaturisatie van de HTM sensor opstelling. Omdat men met spraycoaten ook een hogere resolutie kan bekomen in vergelijking met stempelen, kunnen ook verschillende MIP structuren die elk een ander doelmolecule binden, afgezet worden op hetzelfde substraat. Dit is vooral interessant voor het detecteren van meerdere doelmoleculen tegelijkertijd in een volledige staalanalyse. In dit doctoraat lag de focus op het testen van verschillende manieren om hoog performante MIP gebaseerde sensoren te ontwikkelen die betrouwbaar en goedkoop zijn. De resultaten tonen duidelijk aan dat mits een aantal optimalisatie stappen, deze sensoren het potentieel hebben commercieel gebruikt te worden in de nabije toekomst.