Embryonic brain development is hampered by environmental and genetic insults

Abstract

Microglia are the immune cells of the brain and thus protect it against damage and infections. In recent years, extensive research is conducted in order to examine the role of these cells in the development of the brain. It was found that microglia are important for amongst others regulation of the neuronal precursor pool and modulation of synaptic connections. Proper development of the brain is crucial since disturbances can increase the risk for developing neuropsychiatric disorders such as schizophrenia and autism spectrum disorder. This disturbance in neurodevelopment can be caused by both genetic and environmental risk factors that influence the developing brain. One of these environmental risk factors that received much attention in recent years is the activation of the maternal immune system during pregnancy by for example an infection. In this thesis, we investigated whether maternal infection would influence the activation status of the embryonic microglia and whether it could disturb the normal development of the brain. The immune system of pregnant mice was stimulated by a single or double injection of the synthetic double stranded RNA Poly IC, which mimics a viral infection. Next, the activation status of embryonic microglia was assessed by the expression of several activation markers (Chapter 2). Despite the fact that the immune system of the pregnant mouse was indeed activated (as evidenced by an increase in the proinflammatory cytokine IL6 in the maternal serum) we found no difference in the expression of the different activation markers between immune challenged and control mice. In contrast to other research groups, we also found no schizophrenia- or autism like behavior in the offspring of mothers that received one injection of Poly IC during pregnancy (Chapter 4). To more thoroughly study the role of embryonic microglia in maternal infection, we aimed at creating an inducible genetic mouse model in which microglia could be eliminated by deletion of the PU.1 gene, an important gene in the development of microglia (Chapter 3). Despite the fact that we confirmed genetic recombination of the PU.1 gene, microglia were still present in embryonic and adult brain. The proper development of the brain was not affected by embryonic exposure to Poly IC (Chapter 5). We labeled neuronal precursors with the red fluorescent protein tdTomato by means of in utero electroporation to assess the distribution of labeled cells in the cortex at a later developmental stage. We found that nor one, nor two injections of Poly IC changed the distribution of these labeled cells compared to their respective single or double saline injection controls. However, the distribution of labeled cells differed between animals receiving only one injection compared to those receiving two injections. Whether this effect could be caused by the stress associated with the second injection remains to be investigated. Beside environmental factors, also genetic factors play an important role in neuropsychiatric disease. One of these genes that is associated with schizophrenia is DISC1, a gene in which several different mutations increase the risk for developing a neuropsychiatric disorder. The function of the DISC1 protein is already extensively investigated in neurons but their role in the function of microglia did not receive any attention. In chapter 6 we found that, both at the mRNA and protein level, DISC1 is expressed in primary microglia isolated from young mice and in BV2 cells, an immortalized microglial cell line. To investigate whether DISC1 plays a role in phagocytosis, an important function of microglia, we modified the endogenous expression of this protein in BV2 cells by transfection with different plasmids. We showed that reduction of Disc1 mRNA levels resulted in reduced phagocytosis of latex beads while overexpression of DISC1 did not influence this particular function. Whether DISC1 plays a role in other microglial functions remains to be investigated.

Microglia zijn de immuuncellen van de hersenen en staan daarbij in voor de bescherming tegen beschadiging en infecties. De laatste jaren is echter ook veel onderzoek verricht naar de rol van deze cellen in de ontwikkeling van de hersenen. Microglia zijn van belang voor onder andere de regulatie van de neuronale precursoren en de modulatie van synaptische verbindingen tussen de zenuwcellen. Correcte ontwikkeling van de hersenen is van groot belang aangezien verstoringen hierin het risico vergroten op de ontwikkeling van neuropsychiatrische stoornissen zoals schizofrenie en autisme spectrum stoornis. Een verstoorde hersenontwikkeling kan veroorzaakt worden door zowel genetische als omgevingsfactoren die de hersenontwikkeling beïnvloeden. Eén van deze omgevingsfactoren waaraan de laatste jaren veel aandacht aan besteed is, is de activatie van het maternale immuunsysteem tijdens de zwangerschap door bijvoorbeeld een infectie. In deze thesis onderzochten we of maternale infectie een invloed had op de activatie van de embryonale microglia en of hierdoor de normale ontwikkeling van de hersenen verstoord werd. Het immuunsysteem van zwangere muizen werd gestimuleerd door één of twee injecties met het synthetisch dubbelstrengige RNA Poly IC, waarmee een virale infectie gesimuleerd wordt. Vervolgens werd de activatiestatus van de embryonale microglia bestudeerd aan de hand van de expressie van klassieke activatiemerkers (Hoofdstuk 2). Ondanks het feit dat het immuunsysteem van de moedermuis wel degelijk gestimuleerd werd door de injectie met Poly IC (zoals bepaald door een stijging van het pro-inflammatoire cytokine IL6 in het maternale serum) vonden we geen verschil in de expressie van de verschillende activatiemerkers tussen immuungestimuleerde en controle muizen. In tegenstelling tot andere onderzoeksgroepen vonden we ook geen schizofrenieof autismeachtig gedrag in nakomelingen van moeders die een injectie Poly IC kregen tijdens de zwangerschap (Hoofdstuk 4). Om de rol van embryonale microglia bij maternale infectie beter te bestuderen trachtten we een induceerbaar genetisch muismodel te creëren waarbij microglia geëlimineerd konden worden door uitschakeling van het PU.1 gen, een belangrijk gen in de ontwikkeling van microglia (Hoofdstuk 3). Ondanks het feit dat we genetische recombinatie van het PU.1 gen konden vaststellen bleven microglia aanwezig in embryonale en volwassen hersenen. Ook in de cellulaire ontwikkeling van de hersenen konden we geen effect detecteren van embryonale blootstelling aan Poly IC (Hoofdstuk 5). Om dit te onderzoeken markeerden we neuronale precursorcellen met het rood fluorescente eiwit tdTomato door middel van in utero electroporatie. Op deze manier konden we op een later ontwikkelingsstadium de verdeling van deze cellen in de cortex bepalen. We vonden dat noch één, noch twee injecties met Poly IC de verdeling van deze cellen veranderde ten opzichte van hun respectievelijke enkele en dubbele controleïnjectie. Echter, de verdeling van gemarkeerde cellen verschilde van dieren die slechts één injectie kregen ten opzichte van dieren die twee injecties kregen. Het dient verder onderzocht te worden of dit effect veroorzaakt kon worden door de stress die gepaard ging met de tweede injectie. Behalve omgevingsfactoren spelen ook genetische factoren een belangrijke rol in neuropsychiatrische stoornissen. Een van deze genen die geassocieerd wordt met schizofrenie is DISC1, een gen waarbij verschillende mutaties het risico vergroten op de ontwikkeling van neuropsychiatrische aandoeningen. De functie van het DISC1 eiwit is reeds uitgebreid bestudeerd in neuronen maar onderzoek naar hun rol in de functies van microglia is tot dusver niet onderzocht. In hoofdstuk 6 beschrijven we dat op zowel het mRNA als het eiwit niveau DISC1 effectief tot expressie wordt gebracht in primaire microglia geïsoleerd van jongen muizen en in BV2 cellen, een geïmmortaliseerde micrgoliale cellijn. Om te onderzoeken of DISC1 een rol speelde in fagocytose, een belangrijke functie van microglia, veranderden we de endogene expressie van dit eiwit in BV2 cellen door middel van transfectie met verschillende plasmides. Op deze manier konden we aantonen dat vermindering van Disc1 mRNA leidde tot een verminderde fagocytose van latex partikels terwijl overexpressie van DISC1 hier geen invloed op had. Of DISC1 ook een rol speelt in andere microgliale functies dient nog onderzocht te worden.