Diversity of ligninolytic enzymes and their genes of Cuban strains of Ganoderma genus. Application for biodegradation of xenobiotic compounds

Abstract

Environmental pollution with hazardous wastes containing recalcitrant xenobiotic chemicals has become a major ecological problem. White-rot Fungi (WRF) are considered promising biotechnological tools to complement or replace the current technologies for the removal of many recalcitrant pollutants from industrial wastewaters and contaminated ecosystems. The ligninolytic machinery and the capacity to degrade various xenobiotic compounds of strains belonging to genus Ganoderma have not yet been studied in details. A high diversity of the genus Ganoderma has been reported in Cuba; in spite of this, the diversity of the ligninolytic enzymes and their genes has been poorly explored. This study aimed to examine the diversity of ligninolytic enzymes and their genes of Cuban native strains from the genus Ganoderma and to evaluate the potential involvement of these ligninolytic enzymes in the degradation of xenobiotic compounds. We isolated 13 native WRF strains from decaying wood and trees in urban ecosystems in Havana, Cuba. Based on the results of multiplex PCR with taxa specific primers and sequence analysis, all strains were confirmed as Ganoderma sp. All our Ganoderma sp. strains produced laccase enzymes at higher levels than non-specific peroxidases. Moreover, the laccase isozymes patterns were different between all strains. We determined the diversity of genes encoding laccases and peroxidases using a PCR and cloning approach with basidiomycete-specific primers. Between 2 and 5 laccase genes were detected in each strain. In contrast, only one gene encoding manganese peroxidase or versatile peroxidase were identified in each strain. Most of the translated laccases and peroxidases aminoacid sequences have not been described before. The extracellular crude enzymatic extracts produced by our Ganoderma strains could degrade, with varying rates, the model chromophoric compounds with chemical structure similar to different persistent organic pollutants(POPs) after 12 h of incubation and without addition of redox mediators (Chapter 2). Taking into account the results of the degradative capacities obtained for seven of the Ganoderma strains (UH-B, UH-D, UH-E, UH-G, UH-L, UH-M and B-18), we selected these strains to perform the studies on degradation of the Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAHs) naphthalene, phenanthrene and fluorene (EPApriority pollutants)(Chapter 3). The results of the in vitro degradation of these compounds indicated that crude enzymatic extracts produced by Ganoderma strains were able to differentially degrade the PAHs under investigation (naphthalene 34 - 73 %, phenanthrene 9 - 67 %, fluorene 11 - 64 %). Ganoderma sp. UH-M showed to be the most promising strain for the degradation of these compounds. We found that the PAH oxidation performed by their extracellular enzymes generated more polar and soluble metabolites such as benzoic acid, catechol, phthalic acid and protocatechoic acid allowing us to propose the possible degradation pathways. The treatment of PAHs with the biomass of this fungal strain enhanced the degradation of the three PAHs. The laccase enzymes played an important role in the degradation of these PAHs, however, others biochemical systems and interactions can contribute to the degradation of the pollutants, such as the cytochrome P450 monooxygenase system, the hydroxyl radicals and the level of H2O2 produced by the fungi. Taking into account the degradation efficiencies of the strains Ganoderma sp. UHM and Ganoderma weberianum B-18 to degrade respectively the PAHs and the synthetic dyes, we determined the laccase genes and their isozymes associated to the degradation of these compounds by an analysis of the laccase transcripts and a qualitative comparative secretome approach (Chapter 4). The genes lac 2, lac 4 and lac 6 from strain B-18 as well as genes lac II and lac VII from strain UHM were constitutively expressed, however the presence of pollutants such as the anthraquinone dye Remazol Brilliant Blue R (RBBR) and PAHs induced the biosynthesis of the laccase isoforms encoded by genes lac 3 from B-18 and lac V from UH-M. Some of these genes, such as lac 4, lac 6 and lac II encode for different laccase isoforms with different molecular weights suggesting the synthesis of monomeric and dimeric laccases. The analysis of the secretome by SDS-PAGE and LC-MS/MS analysis of the crude enzymatic extracts produced at the fourth day in SB-U medium by strains B-18 and UH-M, demonstrate the expression of a variety of laccase isoforms and lignocellulolytic enzymes. These proteins are valuable for the degradation of a wide range of lignin-related compounds such as synthetic dyes and PAHs. The comparative secretome analysis performed in presence of pollutants such as RBBR and naphthalene, allowed us to detect new enzymes that were not found in the secretome of these strains at the fourth day in SB-U medium (cultures used as inoculum for the treatment of RBBR and PAHs) and in control cultures (addition of distilled water); confirming that these xenobiotic compounds can switch on the expression of other enzymes in order to degrade and detoxify these recalcitrant pollutants. These findings hold promises for the development of practical applications for the treatment of textile industry wastewaters and also for bioremediation of polluted ecosystems by well-adapted native WRF strains. The results of this study open new opportunities for future research. The differences found in the translated aminoacids sequences corresponding to the laccase signature regions L1 and L2 and in the substrate binding loops (Chapters 2 and 4) indicate that the laccase isozymes detected in the Ganoderma strains might have novel biochemical properties; this can be verified by the purification of each of the laccase isozymes and the determination of the catalytic parameters. In addition, the characterization of promotor regions of laccase genes will also allow a better understanding of the complex regulation of the laccase gene family in the investigated Ganoderma strains. The present study highlights the diversity of genes coding ligninolytic enzymes such as manganese peroxidases, versatile peroxidases and in particular the genes coding for laccase isoforms associated to the degradation of recalcitrant pollutants such as anthraquinone dyes and PAHs by indigenous Ganoderma strains. We also determined the main degradation intermediates of naphthalene, phenanthrene and fluorene and proposed the possible degradation pathways of these PAHs. We described for the first time the potential of the secretome of Ganoderma strains in SB-U medium and in presence of pollutants such as the synthetic dye RBBR and the PAH naphthalene.

La contaminación ambiental con residuos industriales que contienen compuestos xenobióticos es uno de los mayores problemas ecológicos. Los Hongos de Podredumbre Blanca (HPB) se consideran potentes herramientas biotecnológicas para complementar o reemplazar las tecnologías de tratamiento existentes para la eliminación de muchos contaminantes recalcitrantes presentes en efluentes industriales y ecosistemas contaminados. La maquinaria ligninolítica y la capacidad para degradar diversos compuestos xenobióticos de cepas pertenecientes al género Ganoderma no se han estudiado aún con detalle. En Cuba existe una gran biodiversidad del género Ganoderma, a pesar de ello, la diversidad de las enzimas ligninolíticas y sus genes, así como su potencial para la degradación de compuestos xenobióticos ha sido poco explorada. En este trabajo se analizó la diversidad de enzimas ligninolíticas y los genes que las codifican presentes en cepas nativas cubanas del género Ganoderma, así como su contribución a la degradación de compuestos xenobióticos. En este trabajo se aislaron 13 cepas nativas de HPB a partir de troncos de árboles en varios ecosistemas urbanos en La Habana, Cuba. Basándose en los resultados del PCR múltiple realizado con cebadores específicos para el género Ganoderma y el análisis de secuencias, todas las cepas fueron identificadas como Ganoderma sp. Todas las cepas produjeron enzimas lacasas y peroxidasas totales en medio SBU. Los niveles de enzima lacasa fueron marcadamente superiores que los de peroxidasas totales. Estas cepas sintetizan además una amplia diversidad de isoenzimas lacasas. Se determinó la diversidad de genes que codifican lacasas y peroxidasas. Las cepas Ganoderma sp. poseen entre 2-5 genes lacasas. En contraste solo un gen que codifica para Manganeso Peroxidasa o Versátil Peroxidasa fue detectado en las cepas Ganoderma sp. Muchas de las secuencias aminoacídicas deducidas a partir de los fragmentos de genes secuenciados, no han sido previamente descritas. Los extractos crudos enzimáticos decoloraron los compuestos cromóforos modelos con estructura química similar a la de diferentes compuestos orgánicos persistentes en solo 12 horas de tratamiento y sin la adición de mediadores redox (Capítulo 2). Las cepas UH-B, UH-D, UH-E, UH-G, UH-L, UH-M y B-18 resultaron las más eficientes en la producción de enzimas ligninolíticas y en la biodegradación de colorantes de diversa complejidad química. Estas cepas se seleccionaron para llevar a cabo estudios de biodegradación de Hidrocarburos Policíclicos Aromáticos (HPAs) tales como naftaleno, fenantreno y fluoreno (Capítulo 3). Los extractos crudos enzimáticos producidos por las cepas Ganoderma sp. degradaron diferencialmente los HPAs en investigación (naftaleno 34-73%, fenantreno 9- 67%, fluoreno 11-64%). La cepa Ganoderma sp. UH-M resultó ser la más prometedora para la degradación de estos compuestos. La oxidación llevada a cabo por las enzimas extracelulares de esta cepa generó metabolitos polares y solubles tales como el ácido benzoico, catecol, ácido ftálico y ácido protocateico, lo que nos permitió proponer las posibles vías de degradación de los HPAs analizados. El tratamiento de los HPAs con la biomasa de esta cepa favoreció la degradación de estos contaminantes. En el proceso de degradación llevado a cabo por la cepa Ganoderma sp. UH-M las isoenzimas lacasas extracelulares desempeñan un papel importante, sin embargo en condiciones “in vivo”, otros sistemas bioquímicos, procesos e interacciones pueden estar contribuyendo a la degradación del contaminante, tales como el sistema citocromo P450 monooxigenasa fúngico, la formación de H2O2 y de radicales hidroxilos por el hongo. Las cepas Ganoderma weberianum B-18 and Ganoderma sp. UH-M resultaron las más eficientes en la degradación de colorantes sintéticos y de HPAs respectivamente. Con el objetivo de elucidar los mecanismos mediante los cuales estas cepas degradan los compuestos xenobióticos, se determinaron los genes lacasas y sus isoenzimas asociadas a la degradación de estos compuestos xenobióticos. Este estudio se realizó mediante la combinación del análisis de la expresión de los transcriptos de los genes lacasa y un enfoque cualitativo de secretómica comparativa. Los genes lac 2, lac 4 y lac 6 de la cepa B-18 así como los genes lac II y lac VII de la cepa UH-M fueron expresados constitutivamente, sin embargo la presencia de contaminantes tales como el colorante antraquinónico Remazol Azul Brillante R (RBBR) y los HPA indujeron la biosíntesis de las isoformas lacasa codificadas por los genes lac 3 de B-18 y lac V de UH-M. Los genes lac 4, lac 6 y lac II, codifican para diferentes isoenzimas lacasa con diferentes pesos moleculares, lo que sugiere la síntesis de las lacasas monoméricas y diméricas. El análisis de los extractos crudos enzimáticos producidos por ambas cepas al cuarto día en medio SB-U mediante SDS-PAGE y LC-MS / MS mostró la expresión de una variedad de isoenzimas lacasa y enzimas lignocelulolíticas. Estas proteínas son valiosas para la degradación de una amplia gama de compuestos xenobióticos con estructura química similar a la lignina tales como los HPAs y colorantes sintéticos. El análisis comparativo de los secretomas producidos por las cepas en presencia de presencia de los contaminantes RBBR y naftaleno, nos permitió detectar nuevas enzimas que no se detectaron en el secretoma producido por estas cepas en medio SB-U al cuarto día (cultivos utilizados como inóculo para el tratamiento de RBBR y PAHs) y en los controles bióticos (adición de agua destilada). Este resultado demuestra que las cepas Ganoderma weberianum B-18 y Ganoderma sp. UH-M producen las enzimas necesarias para la degradación y detoxificación estos compuestos recalcitrantes. Los resultados de este trabajo marcan la pauta para el desarrollo de futuras aplicaciones prácticas para la degradación de compuestos xenobióticos presentes en efluentes industriales, así como para la biorremediación de ecosistemas contaminados por cepas nativas de HPB adaptadas.