Novel generation poly(p-phenylene ethynylene)s for bio-imaging applications

Abstract

In the medical sector, imaging of fractures, tumors, vains etc. is of high importance to make correct diagnoses and to propose treatments. However, most of the imaging techniques used nowadays are expensive and they are damaging to tissue. Conjugated polymers are of interest to this field because they exhibit excellent optical properties, and they are generally non-cytotoxic. Research into the use of those materials as fluorescent probes for optical imaging is ongoing. For applications in biological media, water solubility is key. Therefore, different techniques to make these conjugated polymers soluble in aqeous environment have been developed. By the introduction of charges on the polymer side chains or backbones, hydrophilicity is increased, leading to a better solubility. However, the most frequently employed technique is the formation of conjugated polymer dispersions in water, by which nanoscale conjugated polymer particles are formed. Unfortunately, the dense packing of the emissive polymer chains in a particle induces fluorescence quenching. In this PhD thesis, an overview was given of the different strategies to improve particle emission (Chapter 2), going from the introduction of bulky side chains and matrix materials to playing around with monomer ratios and polymer freezing in the relaxed state. Furthermore, particle functionalization is important for specific labelling of cells or organelles. A wide variety of functional groups to achieve (bio)conjugation have been studied. The most employed functional moieties are carboxylic acids and N-hydroxy succinimides, which lead to stable amide bonds. Possible alternatives are phenylboronic acid groups, β-cyclodextrins and click functionalities (alkynes, azides, maleimides, ...). When the particles are able to target specific cells, they can act as theranostics, meaning that they can also act as a therapeutic agent by the release of encapsulated drug molecules or by triggering the formation of reactive oxygen species. Poly(p-phenylene ethynylene)s (PPEs) are interesting materials to be used in biosensors as well as imaging probes due to their simple but rigid backbone structure. Moreover, their bandgap is easily adjustable to the application by the introduction of acceptor moieties into the backbone, while the side chains open a lot of opportunities for the introduction of functional groups for the immobilization of (bio)conjugates. The investigation of different synthetic routes towards azide-functionalized PPEs is described in Chapter 3 of this thesis. The azide functionalities are interesting handles for post-polymerization functionalization via copper catalysed alkyne-azide click (CuAAC) chemistry. The azide groups are introduced on the polymer octyloxy side chains, and this in a pre- or post-polymerization functionalization approach. For all of the obtained copolymers, dispersities were comparable (Ð = 2.1−2.4), but some variations in the molar masses of the PPEs synthesized via the different routes were observed. The introduction of azide functionalities on the diiodo-substituted monomers before polymerization leads to the best results (Mn = 28.6 kg/mol). Since alkyne end groups have an influence on gelation of the polymers during reaction (work-up) or processing of the polymers at elevated temperature, endcapping of all copolymers was done. Furthermore, as a proof-of-principle, a first click reaction onto the azidified polymer with phenylacetylene was successfully performed (in solution). The polymer developed in Chapter 3 was formulated into nanoparticles and its properties were compared to those of a more hydrophobic PPE without azide functionalities and a more hydrophilic polymer where the azide functionalities were introduced onto tetraethylene glycol (TEG) side chains (Chapter 4). The influence of the functionalization pattern on the size and the optical properties of the resulting PPE nanoparticles was studied using transmission electron microscopy, dynamic light scattering, UV-Vis absorption and fluorescence spectroscopy. The polymer containing azide functionalized TEG chains afforded larger particles (188 nm compared to 78 nm for non-azidified polymer and 87 nm for the azidified hydrophobic polymer), which can be attributed to hydration of the outer layer and the interior of the more hydrophilic polymer particles. However, this did not impact the fluorescence quantum yield of the nanoparticles. The two azide functionalized PPE particles exhibited the highest quantum yields (13%). As a proof-of-principle, a fluorescent dye was also clicked onto the CPNPs after particle formation. In this thesis, we also introduced a new methodology to improve the photoluminescence quantum yield (PLQY) of conjugated polymer nanoparticles (CPNPs). The synthesis of PPE networks, which are formed by the inclusion of 2D (1,3,5-tribromobenzene) or 3D (2,2',7,7'-tetrabromo-9,9'-spirobifluorene) crosslinkers, is described in Chapter 5. The crosslinkers bridge the different polymer chains and thereby prevent tight stacking in the nanoparticles. Amounts of 3 and 5 mol% of the linkers were introduced during the Sonogashira polymerization reaction and CPNPs were synthesized of all samples. The PLQY of the nanoparticles doubled (from 5% for the linear polymer to 11%) when 5 mol% of 1,3,5-tribromobenzene was introduced and also the fluorescence brightness doubled for each of the crosslinkers when added in 5 mol%. Crosslinker incorporation also seemed to have no influence on the facile particle internalization in cells. Since polymer functionalization is of huge importance to obtain high selectivity for sensing applications, CuAAC functionalization of a randomly alkynylated biological probe (protein A (SpA)) on PPE films was monitored via quartz-crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) in the final Chapter 6. Furthermore, click immobilization is also of interest for (bio)molecule immobilization on CPNPs. A comparison between three different PPE films was made. The first PPE polymer had octyloxy side chains of which 50% were azide terminated. In the second PPE, the non-azide terminated side chains were replaced by TEG side chains while in the third PPE, 50% of azide-terminated TEG side chains were introduced (while the non-functionalized octyloxy side chains are maintained). The variation in side chains caused changes in hydrophilicity of the PPE films. Unfortunately, aspecific interactions between SpA and any of the surfaces made the interpretation of the results troublesome. To circumvent adsorption to the surface, alkynylated oligoethylene glycols were exposed to the surfaces under the same reaction conditions, but here no response could be observed by QCM-D, not even when the concentration was increased 100-fold. As a last option, the films were exposed to randomly alkynylated NbBCII10, but also in this case, no response was detected.

Medische beeldvorming is van groot belang voor het stellen van correcte diagnoses en om goede behandelingen te kunnen voorstellen. Jammer genoeg zijn de meeste beeldvormingstechnieken schadelijk voor bepaalde weefsels en bovendien zijn ze erg duur. Tegenwoordig wordt er veel onderzoek verricht naar het gebruik van geconjugeerde polymeren als beeldvormingssondes aangezien ze zeer goede optische eigenschappen hebben en over het algemeen niet toxisch zijn voor cellen. Het grootste nadeel verbonden aan het gebruik van deze geconjugeerde polymeren is dat ze meestal niet oplosbaar zijn in water. Voor het gebruik in biologisch milieu is dit echter een noodzakelijke voorwaarde en daarom werden er verscheidene technieken ontwikkeld om hun gebruik in waterige omgevingen te vereenvoudigen. Een voor de hand liggende oplossing is de introductie van ladingen op de polymeerketen zelf of op de zijketens. Aangezien dit synthetisch gecompliceerd is, is een makkelijkere en meer gebruikte techniek de vorming van geconjugeerde nanopartikels. Hierbij wordt er een dispersie van het opgeloste polymeer in water gemaakt. Aangezien de verschillende polymeerketens op deze manier dicht bij elkaar gepakt worden in de deeltjes, zijn onderlinge interacties mogelijk en deze leiden meestal tot een demping van de fluorescentie. In deze thesis wordt eerst een overzicht gegeven van de technieken die in de literatuur beschreven staan om de emissieefficiëntie van nanopartikels op basis van geconjugeerde polymeren te verhogen. De meest gebruikte strategie is het introduceren van omvangrijke zijketens en/of het gebruik van matrices. Verder kunnen variatie in de monomeerverhoudingen en het bevriezen van polymeren in hun gerelaxeerde toestand de efficiëntie ook verhogen. Niet enkel een hoge zichtbaarheid van de sondes is noodzakelijk, het is ook van belang dat de nanodeeltjes specifieke cellen of organellen kunnen opsporen en binden. Dit kan gereguleerd worden door bepaalde functionele groepen te introduceren op de polymeerketens, waardoor immobilisatie van eender welk (bio)molecule mogelijk wordt. Verschillende functionele groepen zijn reeds bestudeerd. De belangrijkste zijn de carbonzuren en N-hydroxy succinimiden, die stevige amidebindingen kunnen vormen. Mogelijke alternatieven zijn fenylboorzuren, β-cyclodextrines en clickfunctionaliteiten (alkynen, azides, maleïmides, ...). Wanneer de partikels de specifieke cellen kunnen detecteren, bestaat de mogelijkheid om ze eveneens te laten optreden als therapeutische agentia. Hierbij kan het polymeer bijvoorbeeld zo ontwikkeld worden dat het de productie van reactieve zuurstofverbindingen kan aanwakkeren en op deze manier celsterfte kan veroorzaken. Poly(p-fenyleenethynyleen) (PPE) verbindingen zijn ideale materialen voor het gebruik in beeldvormingstechnieken. Ze hebben een simpele maar stevige structuur die makkelijk synthetisch aanpasbaar is aan de toepassing die men voor ogen heeft. De bandgap kan bijvoorbeeld aangepast worden door andere monomeren in de polymeerketen te introduceren en de zijketens geven heel wat mogelijkheden naar functionalisatie toe. In dit werk wordt de synthese van een azide-gefunctionaliseerd PPE bestudeerd. De azidegroepen zijn interessant voor de clic-immobilisatie van bio(moleculen) via koper-gekatalyseerde azide-alkyn (CuAAC) chemie. Deze functionele groepen zijn geïntroduceerd op het uiteinde van de octyloxy-zijketens van het PPE, en dit zowel in een pre- als postpolymerisatie aanpak. Al de gesynthetiseerde copolymeren hebben vergelijkbare polydispersiteiten (Ð = 2.1−2.4), maar er kon wel een onderscheid gemaakt worden in de moleculaire gewichten van de verschillende materialen. Wanneer de azidefunctionaliteiten geïntroduceerd worden op het dijood-gesubstitueerd monomeer vóór polymerisatie, worden de beste resultaten bekomen (Mn = 28.6 kg/mol). Omdat alkyn-eindgroepen kunnen leiden tot gelatie van het polymeer tijdens de opwerking en de bewaring, worden alle polymeren eindgefunctionaliseerd. Verder is er een eerste stap gezet richting de functionalisatie van de polymeren door middel van CuAAC-chemie. Fenylacetyleen is succesvol geïmmobiliseerd in oplossing. Het azide-gefunctionaliseerd polymeer werd daarna geformuleerd in nanopartikels, waarna de eigenschappen vergeleken werden met partikels gevormd uit een meer hydrofoob en een meer hydrofiel polymeer. Het hydrofobe polymeer heeft geen azide-functionaliteiten terwijl er bij het hydrofiel polymeer tetraethyleenglycol (TEG) zijketens zijn geïntroduceerd. Het effect van het functionalisatiepatroon op de grootte van de PPE deeltjes en op de optische eigenschappen werd bestudeerd aan de hand van transmissie elektron microscopie (TEM), dynamische lichtverstrooiing (DLS), UV-Vis absorptiespectroscopie en fluorescentiespectroscopie. De partikels gevormd uit het hydrofiele polymeer met de TEG-ketens (188 nm) zijn groter dan de andere deeltjes. Dit effect kan verklaard worden door de hydratatie van zowel de periferie als de kern van de partikels. De deeltjes geformuleerd uit de polymeren met azidefunctionaliteiten hebben een hogere fluorescentie-quantumopbrengst (13%) dan de partikels zonder azides. Om aan te tonen dat de azidegroepen bruikbaar zijn voor de immobilisatie van (bio)moleculen, werd er een fluorescente kleurstof aan de nanodeeltjes gehecht als eerste test. Verder wordt er in deze thesis een nieuwe methode voorgesteld om de quantumopbrengst van geconjugeerde nanodeeltjes te vergroten. De synthese van niet-gefunctionaliseerde PPE-netwerken, welke gevormd zijn door de incorporatie van 2D (1,3,5-tribroombenzene) en 3D (2,2’,7,7’-tetrabroom-9,9’- spirobifluoreen) crosslinkers wordt beschreven in hoofdstuk 5 van dit werk. De crosslinkers vormen bruggen tussen de verschillende polymeerketens waardoor ze stapeling van de ketens in de nanodeeltjes voorkomen. Beide crosslinkers werden zowel in 3 als 5 mol% toegevoegd tijdens de Sonogashira polymerisatiereacties. Nanodeeltjes van alle stalen werden geformuleerd en gekarakteriseerd. De fluorescentie quantumopbrengst van de deeltjes verdubbelt (van 5 tot 11%) na het toevoegen van 5% 1,3,5-tribroombenzeen en bovendien is er ook een opmerkelijke verbetering merkbaar in de helderheid van de deeltjes. Verder heeft crosslinking geen invloed op de makkelijke opname van de deeltjes in cellen. Omdat de functionalisatie van polymeren van groot belang is voor de ontwikkeling van selectieve sensoren, werd de CuAAC-immobilisatie van een random gealkyneerde biologische probe (proteine A (SpA)) op PPE films bestudeerd aan de hand van QCM-D. Een vergelijking tussen drie verschillende PPE-films werd gemaakt. De eerste film bestaat uit het azide-gefunctionaliseerd PPE waarvan de synthese beschreven werd in hoofdstuk 3. Het polymeer werd vergeleken met twee meer hydrofiele polymeren. Bij het eerste polymeer zijn de niet-gefunctionaliseerde octyloxy-zijketens vervangen door TEG-ketens, terwijl bij het tweede polymeer de niet-gefunctionaliseerde octyloxy-zijketens behouden werden en het azide geïntroduceerd werd op het uiteinde van de TEGzijketens. Jammer genoeg treden er aspecifieke interacties op tussen de polymeerfilms en het SpA, waardoor de interpretatie van de resultaten lastig is. Om adsorptie te vermijden werd in een tweede poging gekozen voor oligoethyleenglycolen met verschillende moleculaire massa’s en in verschillende concentraties, maar hier werd geen signaal gedetecteerd na blootstelling van de PPE-films. In een laatste poging werden de films blootgesteld aan reactiemengsels met random gealkyneerd NbBCII10, maar ook hier werd geen respons waargenomen.