Seed endophytes of Arabidopsis thaliana and Agrostis capillaris: community composition and importance for plant growth

Abstract

Transgenerational signaling allows plants to adapt in a fast and efficient manner to biotic and abiotic stresses. Transgenerational plasticity can be mediated by maternally derived proteins, mRNAs and hormones, via DNA methylation and histone modifications, or via seed provisioning. Seed-transmitted endophytes could also play a role in this process, as was already shown for fungal endophytes of grasses. Vertically transmitted endophytes usually evolve to have a mutualistic relationship with their host in which they are able to improve plant growth and health. In the first section, the objective was to understand how different factors affect the bacterial community present in seeds. To study the impact of Cd on the seed endophytic community, a selection pressure was simulated in Arabidopsis thaliana in order to create 2 types of seeds: from plants that were exposed to 2 µM Cd for several generations (Cd seeds) and from plants that were grown in parallel but never exposed to Cd (control seeds). The cultivable as well as the total endophytic communities of both seed types were characterized. Some bacterial genera, such as Rhizobium and Pseudomonas, appeared to be tightly associated with A. thaliana seeds, while others were specialized endophytes that are selectively taken up. Important bacterial characteristics for transfer to the next generations of plants were ACC deaminase activity and Cd tolerance in Cd seeds, and IAA production in control as well as Cd seeds. The presence of these selected endophytic communities in seedlings makes rapid adaptation to environmental conditions possible by stimulating different beneficial functions. To verify whether the selection pressure induced in the lab-grown A. thaliana was comparable with a selection pressure occurring in the field, the cultivable endophytic communities associated with seeds of Agrostis capillaris from a longterm Cd/Ni contaminated field site and a non-contaminated field site were identified and characterized. Also in A. capillaris, bacterial ACC deaminase activity appeared to be very important for coping with Cd stress. Surprisingly, Cd tolerance was almost absent in seed endophytes from long-term Cd/Niexposed A. capillaris. This can be attributed to the pseudometallophyte nature of A. capillaris: metal exclusion from aerial parts as well as metal compartmentalization and complexation makes the development of metal tolerance mechanisms in endophytes present in A. capillaris redundant. In order to determine the influences of the substrate type, the seed endophytic communities of A. thaliana were also identified and characterized after generations of culturing on sand and on a mixture of sand and potting soil, 2 commonly used substrates for the production of A. thaliana seeds. The seeds harvested from plants growing on sand and potting soil were sown again, but this time on the same substrate, to determine if the substrate type still had an influence on the establishment of the plant endophytic community. Despite differences in the soil bacterial communities, the seed and radicle endophytic communities were very similar, which indicates that plants are able to select their endophytes. On the other hand, the leaf endophytic community showed to be mainly derived from the environment and not from the seed. This indicates that bacteria are recruited from the environment during plant growth to complement the endophytic community from which the seed endophytes of the next generation can again be selected. Moreover, it appeared that the genera that were most abundant in the cultivable endophytic community, mainly Rhizobium and Pseudomonas, coincide with the genera frequently detected in the total community. In the second section, the importance of bacterial seed endophytes for seedling establishment and plant growth were studied. It was verified whether the in vitro plant growth promoting characteristics of A. thaliana and A. capillaris seed endophytes could be a predictor of in planta growth promotion. The effect of inoculation with the isolated seed endophytes on the growth and metal uptake of their host during Cd exposure was studied in order to evaluate their possible contribution to bacteria-assisted phytoremediation as a clean-up strategy. Inoculation of A. thaliana with its seed endophytes on vertical agar plates or in a hydroponic culture led to improved plant growth upon Cd exposure, however results were not consistent. Therefore several features possibly involved in bacterial colonization and inoculation success were analysed. Different bacterial growth stages were associated with changes in motility, chemotactic behavior and pectinase activity, which could influence the plant colonizing capacity of the inoculated endophytes. Inoculation of A. capillaris growing in a hydroponic culture with its seed endophytes resulted in a significantly improved plant growth in case of nonexposed plants. After inoculation of Cd-exposed plants, an increased Cd uptake was achieved without affecting plant growth. This indicates that inoculation of A. capillaris with its seed endophytes might be beneficial for plant establishment and growth during phytostabilization and phytoextraction of Cd-contaminated soils. In conclusion, plants appear to be able to select which endophytes are transferred to the next generation, primarily on a phenotypic but probably also on a genotypic level. Understanding how different factors influence the seed endophytic community can improve seed quality and plant growth during different biotechnological applications. Seed endophytes seem to have the potential to contribute to a more efficient phytostabilization and phytoextraction of metal-contaminated areas, although it remains difficult to predict in planta behavior based on in vitro plant growth promoting characteristics. Moreover, optimization of the inoculation procedure is needed to generate a more stable and repeatable inoculation outcome.

Transgenerationele signalisatie laat planten toe om zich op een snelle en efficiënte wijze aan te passen aan biotische en abiotische stressfactoren. Transgenerationele plasticiteit kan verlopen via maternale eiwitten, mRNA en hormonen, via DNA methylatie en modificatie van histonen, en via zaadvulling. Endofyten die overgedragen worden via de zaden kunnen ook bijdragen aan dit proces zoals reeds werd aangetoond voor endofytische schimmels in grassen. Verticaal overgedragen endofyten hebben meestal een mutualistische relatie met hun gastheer waarbij ze de groei en gezondheid van de plant kunnen bevorderen. In deel 1 werden de effecten van verschillende factoren op de bacteriële gemeenschap aanwezig in zaden bestudeerd. Om de impact van Cd op de zaadendofyt-gemeenschap te bestuderen, werd een selectiedruk gesimuleerd bij Arabidopsis thaliana waardoor 2 zaadtypes tot stand kwamen: van planten die blootgesteld werden aan 2 µM Cd gedurende verschillende generaties (Cd zaden) en van planten die in parallel groeiden maar nooit blootgesteld werden aan Cd (controlezaden). Zowel de cultiveerbare als de totale endofytische gemeenschappen van beide zaadtypes werden gekarakteriseerd. Enkele bacteriële genera, zoals Rhizobium en Pseudomonas, waren nauw geassocieerd met de zaden van A. thaliana, terwijl andere genera meer gespecialiseerde endofyten bleken te zijn die selectief werden opgenomen. Belangrijke bacteriële kenmerken voor transfer naar de volgende generatie van planten waren ACC deaminase activiteit en Cd tolerantie in de Cd zaden, en IAA productie in beide zaadtypes. De aanwezigheid van geselecteerde endofytische gemeenschappen in de zaailingen maakt snelle aanpassingen aan veranderingen in de omgeving mogelijk doordat verschillende gunstige functies gestimuleerd kunnen worden. Vervolgens werd nagegaan of de selectiedruk die geïnduceerd werd in de labogekweekte A. thaliana vergelijkbaar is met een selectiedruk aanwezig in een veldsituatie. Hiervoor werden de cultiveerbare endofytische gemeenschappen geassocieerd met de zaden van Agrostis capillaris groeiend op een veldsite die langdurig gecontamineerd is met Cd en Ni en op een niet-gecontamineerde controlesite geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Ook in A. capillaris bleek bacteriële ACC deaminase activiteit belangrijk om te kunnen omgaan met Cd stress. Opmerkelijk was dat er nauwelijks Cd tolerante endofyten aanwezig waren in de zaden van Cd/Ni-blootgestelde A. capillaris. Dit kan te wijten zijn aan het pseudometallofyt karakter van A. capillaris: exclusie van metalen uit de bovengrondse delen alsook compartimentalisatie en complexatie maken de ontwikkeling van metaaltolerantie mechanismen in endofyten aanwezig in A. capillaris overbodig. Om het effect van het substraat te bepalen, werd de zaadendofyt-gemeenschap van A. thaliana ook geïdentificeerd en gekarakteriseerd na verschillende generaties gekweekt te zijn op zand en op een mengeling van zand en potgrond, 2 veelgebruikte substraten voor het produceren van A. thaliana zaden. De zaden geoogst van op zand en op potgrond gegroeide planten werden vervolgens opnieuw gezaaid, maar dan op hetzelfde substraat, om na te gaan of het substraat nog altijd een effect heeft op de endofytische gemeenschap van de plant. Ondanks verschillen in de aanwezige bodembacteriën waren de endofytische gemeenschappen in de zaden en kiemwortels zeer gelijkaardig. Dit wijst erop dat de plant in staat is om bepaalde bacteriële stammen te selecteren als endofyt. Daarentegen was de endofytische gemeenschap in de bladeren hoofdzakelijk afkomstig van de omgeving en niet van de zaden. Dit wijst erop dat tijdens de groei van de plant bacteriën gerekruteerd worden uit de omgeving om de endofytische gemeenschap te vervolledigen. Vanuit deze gemeenschap kunnen dan opnieuw de zaadendofyten van de volgende generatie geselecteerd worden. Bovendien bleken de genera die het meest voorkwamen in de cultiveerbare gemeenschap, hoofdzakelijk Rhizobium en Pseudomonas, ook de genera te zijn die het meest gedetecteerd werden in de totale gemeenschap. In deel 2 werd het belang van bacteriële zaadendofyten voor de ontwikkeling van de zaailing en de verdere groei van de plant bestudeerd. Er werd nagegaan of de plantengroei bevorderende eigenschappen die in vitro gedetecteerd werden in de zaadendofyten van A. thaliana en A. capillaris een goede indicatie vormen voor hun in planta effecten. Het effect van inoculatie met de geïsoleerde zaadendofyten op de groei en metaalopname van hun gastheer tijdens blootstelling aan Cd werd bestudeerd om zo hun mogelijke bijdrage aan bacterie-geassisteerde fytoremediatie als saneringsstrategie in te schatten. Inoculatie van A. thaliana met zijn zaadendofyten op verticale agarplaten of in een hydrocultuur bevorderde de plantengroei bij blootstelling aan Cd, maar deze resultaten waren niet consistent. Daarom werden verschillende factoren die betrokken zijn bij bacteriële kolonisatie van de plant, en die dus het succes van de inoculatie kunnen beïnvloeden, onderzocht. Verschillende bacteriële groeifasen bleken geassocieerd met veranderingen in motiliteit, chemotaxis en pectinase activiteit, hetgeen de capaciteit van de geïnoculeerde endofyten om de plant te koloniseren kan beïnvloeden. Inoculatie van A. capillaris met zijn zaadendofyten in een hydrocultuur resulteerde in een significant verbeterde groei in de niet-blootgestelde planten. Na inoculatie van de Cd-blootgestelde planten werd een verhoogde Cd opname bekomen zonder dat dit een negatief effect had op de plantengroei. Dit wijst erop dat inoculatie van A. capillaris met zijn zaadendofyten gunstig kan zijn voor de ontwikkeling en groei van de plant tijdens fytostabilisatie en fytoextractie van bodems verontreinigd met Cd. Planten lijken dus in staat om te selecteren welke endofyten er naar de volgende generatie worden overgedragen, hoofdzakelijk op een fenotypisch, maar ook op een genotypisch niveau. Kennis van de effecten van verschillende factoren op de zaadendofyt-gemeenschap is belangrijk aangezien het de zaadkwaliteit en plantengroei kan verbeteren tijdens uiteenlopende biotechnologische toepassingen. Zaadendofyten lijken te kunnen bijdragen aan een efficiëntere fytostabilisatie en fytoextractie van metaalverontreinigde gronden, hoewel het moeilijk blijft om in planta gedrag te voorspellen op basis van in vitro bestudeerde plantengroei promoverende eigenschappen. Bovendien is er een optimalisatie van de inoculatieprocedure nodig zodat een consistenter en beter herhaalbaar resultaat verkregen kan worden.