Please use this identifier to cite or link to this item:
http://hdl.handle.net/1942/25283
Title: | Functional characterisation of heavy metal transporting P-type ATPases and metallothioneins of the ectomycorrhizal fungus Suillus luteus | Authors: | NGUYEN, Hoai | Advisors: | COLPAERT, Jan | Issue Date: | 2016 | Abstract: | The basidiomycete Suillus luteus is an important ectomycorrhizal fungus of
young pine trees. The high occurrence of S. luteus in pioneer forests on heavy
metal polluted sites in Europe prompted a number of studies on metal tolerance
in the fungus. Ecotypes of S. luteus that are tolerant to zinc, cadmium and
copper have been found on highly toxic soils. These ecotypes have been shown
to be effective in ameliorating the effects of metal toxicity on the host plant.
Until now, the mechanisms that are involved in metal homeostasis and
detoxification in S. luteus are largely unknown.
This study aimed to identify and investigate the function of a family of heavy
metal transporters — the P1B-type ATPases — and of heavy metal chelators —
metallothioneins (MTs) — in S. luteus with special focus on Cu homeostasis.
The P1B-type ATPases or HMAs are a subfamily of P-type ATPases that are
involved in the transport of heavy metals (Cu, Zn, Cd, Co, Ag and Pb). HMAs are
found in bacteria, archaea and eukarya and are suggested to have evolved early
in evolution. In fungi, except for those found in the model yeast species, only
few HMAs have been identified. In the last few years, the complete genomes of
numerous fungi including S. luteus gradually have become available. We applied
bioinformatic approaches using computational predictions, homology and motif
analysis to evaluate HMAs diversity, abundance and to predict their functions in
345 putative HMA protein sequences of 132 basidiomycetes and 17 early
diverging fungi (Chapter 2). The data revealed that the HMAs in Basidiomycetes
subdivide to form three distinct clusters. The three are: CCC2-, CRD1-, and
PCA1-type HMAs which have members that are homologous to the
Saccharomyces cerevisiae Ccc2p (copper-), Pca1p (cadmium-) and the Candida
albicans Crd1p (copper–transporting) proteins. We show that HMAs are
ubiquitously present in most fungi analyzed. Among the three types, the CCC2-
type is the most evolutionary conserved; the CRD1- and PCA1-types are specific
for fungi and have never been investigated (except in the model yeasts). We
show later in Chapter 3 that the CRD1-type representatives in S. luteus are involved in Cu and Cd homeostasis and detoxification. Our data revealed that
several PCA1-type HMAs are likely Zn-transporting ATPases. The latter group
was thought not to exist in fungi.
More important, three genes coding for the CCC2- and CRD1-type HMAs in S.
luteus were further studied in Chapter 3. A yeast (S. cerevisiae) expression
system was used to investigate the function and sub-cellular localization of the
corresponding proteins. Expression of the genes in S. luteus exposed to different
metals was analyzed using quantitative real-time PCR. The CCC2-type
representative in S. luteus (SlHma1) is confirmed as a Cu exporter localized in
the ER-Golgi similar to its S. cerevisiae ortholog that is an essential component
of the secretory pathway. Heterologous expression of SlHma1 complements ccc2
mutant yeast. Expression of SlHMA1 gene increases when S. luteus is exposed
to high Cu. Heterologous expression of CRD1-type HMAs (SlHma2 and SlHma3)
in yeast does not result in functional Cu transport proteins. However, expression
of the two HMAs’ metal binding domain rescues both Cu and Cd sensitive
mutants. Moreover, transcription of SlHMA2 and SlHMA3 strongly increases
when S. luteus is exposed to high Cu and Cd conditions. These results indicate
that SlHma2 and 3 are involved in Cu homeostasis and Cd detoxification in S.
luteus.
In the present study, we discovered a novel, highly conserved family of
metallothioneins that is present in S. luteus and a number of basidiomycete
fungi (Chapter 4). The two metallothionein genes SlMTa and SlMTb of S. luteus
were experimentally studied; they show typical Cu-thionein characteristics. The
highly conserved amino acid sequences of this family of MTs indicates that these
MTs must have essential functions. It will be interesting in the subsequent
experiments to investigate the roles of these MTs in different biological
processes and developmental stages of Basidiomycota.
Results of this study open new opportunities for future research. The putative
copper chaperones and metal responsive transcription factors identified in
Chapter 3 are likely involved in the function and the regulation of HMA
transporters; this can be verified by further characterization. Results from this
study also suggest a link between Cu and Fe transport via the function of the CCC2-type HMAs (SlHma1 in S. luteus) and between Cu and Cd via the metal
binding ability of the CRD1-type HMAs (SlHma2 and SlHma3 in S. luteus).
All together, the present study highlights the role of three P1B-type ATPase
transporters and two novel metallothioneins in Cu homeostasis and, to a certain
extent, Cd detoxification in S. luteus. Moreover, we call attention to the
involvement of different types of P1B-type ATPases in metal homeostasis in
basidiomycete fungi. We discovered a novel family of metallothioneins that will
be useful in further research on metal homeostasis and tolerance of
basidiomycete fungi. De basidiomyceet Suillus luteus is een belangrijke ectomycorrhizaschimmel van jonge dennenbomen. Het frequent voorkomen van S. luteus in pioniersbossen op door zware metalen vervuilde sites in Europa heeft geleid tot meerdere studies waarbij metaaltolerantie van deze schimmel centraal stond. Op toxische bodems werden ecotypes van S. luteus gevonden die verhoogde toleranties voor zink, cadmium en koper vertonen. In eerdere studies werd aangetoond dat metaaltolerante ecotypes effectief zijn in het reduceren van de toxische effecten van zware metalen op jonge dennenplanten. Tot op heden zijn de mechanismen betrokken bij de metaalhomeostase en detoxificatie in S. luteus nog grotendeels onbekend. Deze studie heeft als doel om in S. luteus, de werking van een familie van zware metalen transporters, de P1B-type ATPases, en van de metaal-chelerende metallothioneïnes (MTs), te identificeren en te onderzoeken met een speciale focus op koperhomeostase. De P1B-type ATPases of HMA’s zijn een onderfamilie van de P-type ATPases die gekend zijn voor het transport van zware metalen (Cu, Zn, Cd, Co, Ag en Pb). Deze HMA’s zijn teruggevonden in bacteriën, archaea en eukaryoten en worden beschouwd als vroeg geëvolueerd in de evolutie. In schimmels werden met uitzondering van de metaal transporters die werden teruggevonden in de modelgisten, slechts enkele HMA’s geïdentificeerd. In de laatste jaren zijn de volledige genomen van meerdere fungi waaronder S. luteus gradueel beschikbaar geworden. Bio-informatica tools werden bij deze studie ingezet om bij 345 mogelijke HMA proteïne sequenties van 132 basidiomyceten en 17 vroeg divergerende schimmels (Hoofdstuk 2) de aanwezigheid en diversiteit van de HMA’s te evalueren evenals hun functies te voorspellen. De bekomen gegevens hebben aangetoond dat de HMA’s in de basidiomyceten onderverdeeld kunnen worden in 3 verschillende clusters. Deze 3 clusters zijn CCC2-, CRD1-, en PCA1- type HMA’s die vertegenwoordigers hebben die respectievelijk homoloog zijn aan de Saccharomyces cerevisiae Ccc2p, Pca1p transporteiwitten en de Candida albicans Crd1p transporters. Het onderzoek toont aan dat HMA genen veelvoorkomend aanwezig zijn in de geanalyseerde schimmelgenomen. Van deze 3 types zijn er 2 types (de CRD1- en PCA1-types) die specifiek zijn voor schimmels en nooit eerder werden geanalyseerd (met uitzondering van de modelgisten). Ons onderzoek toont aan dat de S. luteus HMA’s van het CRD1-type betrokken zijn bij koper- en cadmiumhomeostase en detoxificatie (Hoofdstuk 3). Daarnaast toonden de bekomen gegevens aan dat meerdere PCA1-type HMA’s waarschijnlijk zinktransporterende ATPases zijn waarvan eerder aangenomen werd dat deze laatste groep niet voorkomt in fungi. Een belangrijke vaststelling is dat de evolutionair meest geconserveerde HMAs in basidiomyceten behoren tot het CCC2-type. De CCC2-type vertegenwoordiger in S. luteus (SlHma1) is experimenteel bevestigd als een koper exporter gelokaliseerd in het ER-Golgi, gelijkaardig aan zijn S. cerevisiae ortholoog dat een essentiële component is van het secretiesysteem in gist (Hoofdstuk 3). Een nieuwe, evolutionair sterk geconserveerde familie van metallothioneïnen werd tijdens dit onderzoek ontdekt in S. luteus en in een aantal andere basidiomycete schimmels (Hoofdstuk 4). De twee metallothioneïne genen SlMTa en SlMTb van S. luteus werden experimenteel bestudeerd en vertonen de typische kenmerken van een kopermetallothioneïne. De sterk geconserveerde aminozuursequenties van deze familie van metallothioneïnen is een indicatie dat deze metallothioneïnen een essentiële functie vervullen in de Basidiomycota. Vervolgexperimenten zijn nodig om de invloed van metallothioneïnen op de verschillende biologische processen en in verschillende ontwikkelingsstadia van S. luteus en andere basidiomyceten te bepalen. Daarenboven openen de resultaten van deze studie nieuwe perspectieven voor verder onderzoek. De mogelijke koperchaperones en metaal responsieve transcriptiefactoren geïdentificeerd in Hoofdstuk 3 zijn waarschijnlijk betrokken bij het functioneren en de regulatie van de HMA transporters. Dit kan worden nagegaan door verdere karakterisering. Resultaten van deze studie suggereren ook een verband tussen koper en ijzer transport via de functie van de CCC2-type HMA’s (SlHma1 in S. luteus) en tussen koper en cadmium via de metaal bindende capaciteit van de CRD1-type HMAs (SlHma2 and SlHma3 in S. luteus). Alles bij elkaar beschouwd brengt deze studie meer duidelijkheid over de rol van drie P1B-type ATPase transporters en twee nieuwe metallothioneïnen in koperhomeostase en, tot op zekere hoogte, cadmiumdetoxificatie in S. luteus. Daarnaast wordt ook gewezen op de mogelijke betrokkenheid van verschillende types van de P1B-type ATPases in metaalhomeostase in de Basidiomycota. Er werd een nieuwe familie van metallothioneïnen ontdekt die van nut zal zijn voor verder onderzoek naar metaalhomeostase en –tolerantie in deze grote groep van fungi. |
Document URI: | http://hdl.handle.net/1942/25283 | Category: | T1 | Type: | Theses and Dissertations |
Appears in Collections: | PhD theses Research publications |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
9784 D-2016-2451-2 Hoai Nguyen.pdf | 4.75 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.