Model development for image analysis in second harmonic imaging microscopy

Abstract

Microscopie gebaseerd op het principe van second harmonic generation (SHG), of opwekking van de tweede harmonische, is een techniek die verwant is aan fluorescentiemicroscopie wanneer het toegepast wordt in het kader van biologisch onderzoek. Het basisprincipe van beide microscopietechnieken is het visualiseren van specifieke structuren met een zeer sterk contrast doordat het gegenereerde signaal een verschillende golflengte heeft dan die van de belichting. Daar waar fluorescentie vooral gebaseerd is op het inbrengen van fluorescente stoffen die eenduidig gebonden worden op de moleculaire structuur waarin men geïnteresseerd is, berust het SHG fenomeen op intrinsieke symmetrie-eigenschappen van een eerder beperkt aantal biologische structuren zoals bijvoorbeeld collageen, myosine, tubuline, amylopectine of cellulose. De biologische structuren waarop SHG microscopie werd toegepast in dit werk zijn voornamelijk type I collageen, en myosine dat aanwezig is binnen gestreept spierweefsel. Sinds de introductie van SHG microscopie op biologisch weefsel is er reeds veel onderzoek gebeurd waarbij specifieke structuren voornamelijk morfologisch onderzocht werden. Dit is dikwijls een eerste en eenvoudige aanpak wanneer SHG microscopie wordt toegepast. Maar door het beperkt aantal biologische structuren die de capaciteit bezitten tot SHG, botst men al snel op één van de limieten van deze techniek. Een volgende stap in het toepassen van SHG microscopie is het bestuderen van de moleculaire eigenschappen. Dit gebeurt doorgaans door het opstellen van fysische en biofysische modellen van de onderzochte moleculaire structuren. Daarbij wordt onder meer de ruimtelijke verdeling in rekening gebracht, maar ook de gevolgen van het veranderen van de polarisatie van de belichtingslaser op het SHG signaal worden bestudeerd. In dit werk hebben we een bijdrage geleverd aan dit soort onderzoek, met het oog op de toepassing van de bestaande modellen in een biologische en biomedische context. Hiervoor hebben we de toepasbaarheid van die modellen getoetst voor gerichte biologische doelstellingen, en indien nodig uitgebreid en gekoppeld aan geautomatiseerde analysealgoritmes voor een snelle en eenduidige dataverwerking. In hoofdstuk 1 wordt in een algemene introductie een kader geschept voor het gedane onderzoek en de gebruikte technieken in dit werk. In hoofstuk 2 wordt de theoretische basis gegeven waarop het voorgestelde werk, en de bestaande biofysische SHG modellen berusten. Bovendien worden er enkele berekeningen getoond die verder niet gebruikt worden in dit werk, maar eerder dienen als een referentie voor verder onderzoek. In hoofdstuk 3 geven we een beschrijving van het gebruikte microscopiesysteem, samen met de aanpassingen die van belang waren om ons onderzoek uit te voeren. Het werk dat verricht werd in verband met collageen type I structuren wordt toegelicht in hoofdstuk 4. De doelstelling in dit hoofdstuk was het karakteriseren van hydrogelen gemaakt van collageen type I op basis van SHG beelden van zo een hydrogel. Een collageen type I hydrogel bestaat uit een verzameling van allemaal willekeurig georiënteerde collageenfibrillen. Afhankelijk van de dichtheid en de willekeurigheid van die fibrillen, heeft de hydrogel unieke mechanische eigenschappen die van belang zijn voor de ontwikkeling en het gedrag van ingebrachte biologische cellen. Omdat het gaat over willekeuren structuren, en omwille van de bestaande expertise van de onderzoeksgroep, hebben we gebruik gemaakt van beeldcorrelatietechnieken waardoor een beeld op een statistische wijze geanalyseerd kan worden. Aangezien de bestaande correlatietechnieken telkens gebaseerd zijn op puntbronnen, hebben we een nieuw theoretisch model geïntroduceerd waarbij draadachtige structuren in rekening gebracht worden. In hoofdstukken 5, 6 en 7 bespreken we de experimenten en resultaten betreffende ons SHG onderzoek op gestreepte spier structuren. Dit werk werd geïnitieerd door het zeer interessante supra-moleculaire SHG model voor skeletspieren, geïntroduceerd door Rouède et al. [36]. In dit model worden de ruimtelijke en moleculaire eigenschappen die een rol spelen bij de opbouw van het SHG signaal in rekening gebracht. Aangezien er werd gesuggereerd dat het model van waarde was bij het onderzoeken van sarcomeerdegradatie ten gevolge van een wanorde van myosinemoleculen binnen dikke filamenten, hebben we dit model willen toepassen om ziektegeïnduceerde spierdegradatie te onderzoeken. Maar, door de beperkte kennis van het model, waren we genoodzaakt eerst een grondig onderzoek te doen naar de toepasbaarheid ervan. Dit wordt toegelicht in hoofdstuk 5. Hier wordt het effect van de verandering van de brekingsindex tussen belichtings- en signaalgolflengtes bestudeerd, laten we zien wat het effect van hoge vergroting is op de intensiteitsprofielen, en bespreken we dat de manier waarop myosine moleculen geordend zijn binnen de dikke filamenten van sarcomeren een rol spelen bij signaalvorming. De voornaamste conclusie luidt dat de filamentlengtes bekomen door SHG microscopie in combinatie met het supra-moleculaire model niet rechtstreeks vergeleken kunnen worden met die van electronenmicroscopie, zoals nu gangbaar is in de literatuur. Zo is de A-band lengte bekomen bij SHG microscopie ∼1.4 µm in plaats van de welgekende ∼1.6 µm bekomen door electronenmicroscopie. In hoofdstuk 6 wordt een nieuwe, automatische beeldverwerkingstechniek geïntroduceerd om de regelmaat van sarcomeren binnen het spierstaal in kaart te brengen. Deze analyse is gebaseerd op een Gabortransformatie, en wordt gerelateerd aan de structurele informatie die bekomen kan worden met het model besproken in hoofdstuk 5. Het bijhorende algoritme om de beelden te analyseren wordt in detail besproken, en wordt toegepast op stalen afkomstig van dieren met verschillende gradaties van experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), een diermodel dat vaak gebruikt wordt bij onderzoek naar multiple sclerose, en een ziekte die door verlamming een effect zou hebben op de sarcomeerstructuur van skeletspieren. Als laatste, in hoofdstuk7, hebben we het effect van de afmetingen van een spierstaal op de SHG intensiteitsprofielen bestudeerd. Hier bleek dat, naast de wanorde van myosine binnen het dikke filament zoals besproken in hoofstuk 5, ook de dikte van het staal het intensiteitsprofiel doet veranderen. Dit betekent dat indien de afmetingen van het staal te klein zijn, de analyse besproken in hoofdstuk 5 en 6 een vertekend beeld kan geven van de regelmaat van sarcomeren binnen het staal.