Exploring microbial communities on a chlorendic acid polluted site and their potential use in bio- and phytoremediation

Abstract

Chlorendic acid is a highly chlorinated, recalcitrant organic compound, that is considered to be resistant to biological degradation. Until now, no microorganisms have been identified yet that can degrade chlorendic acid. This thesis aimed to investigate the potential to remediate recalcitrant organic pollutants, like chlorendic acid, by using biological techniques. Therefore, the bacterial and fungal communities native to a chlorendic acid polluted site were investigated for their potential application in bio- and phytoremediation of chlorendic acid. It is essential to first gain an understanding concerning the effects of a pollutant on the native microbial communities. Therefore, in the first section, the effects of chlorendic acid on the native soil bacterial and fungal communities were investigated. Also the effects of soil depth were taken into account. Chlorendic acid had a more pronounced effect on soil bacterial diversity than soil depth, whereas for fungi the opposite was the case and soil depth mainly determined fungal diversity. A differentiation was apparent between the bacterial communities of the moderate and high polluted soils and the low polluted soil at -1 m and -2 m, while no differentiation based on presence of chlorendic acid was evident for the fungal communities. These findings might indicate that the fungal community has a higher resilience to chlorendic acid than the bacterial community. However, both bacterial and fungal communities comprised members that were more prevalent in the higher polluted soil or the less polluted soil, indicating that chlorendic acid has effects on specific taxa. Taxa that are more dominant in higher polluted soil could be interesting to explore for their capacity to degrade chlorendic acid. Since both, bacterial and fungal communities, contain such taxa, both bacteria and fungi should be investigated for their chlorendic acid degrading capacities. Also soil depth selected for different members of the communities. Therefore, during in situ bioaugmentation, care should be taken to inoculate degraders at the right depth. This to ensure a successful introduction and establishment of the inoculated strains into the native microbial communities. In the second section, the feasibility to exploit the native bacterial and fungal communities to improve phytoremediation of chlorendic acid was explored. Both bacteria and fungi with the capacity to degrade chlorendic acid in liquid media could be isolated. However, the isolated fungi showed to be considerably more efficient in degrading chlorendic acid than the isolated bacteria. The chlorendic acid degrading fungal strains produced more hydroxyl radicals upon exposure to chlorendic acid in comparison to the non-degrading control. Therefore, fungal production of hydroxyl radicals via induction of Fenton chemistry is the suggested mechanism of fungal degradation of chlorendic acid. Because of the low substrate specificity of hydroxyl radicals, the isolated chlorendic acid degrading fungal strains could also be promising for use in bioremediation of other organic pollutants. One fungal strain, Penicillium canescens 1D-2a, decreasing the chlorendic acid concentration in a soil to less than 55% of the original concentration after 28 days. Furthermore, the isolated bacteria were screened for their plant growth promoting capacities. All 330 isolates showed in vitro plant growth promoting traits. Ten consortia of 5 bacterial strains each were selected for testing of in planta plant growth promotion. However, no significant effects on plant growth were observed. One bacterial consortium seemed to have a positive influence on plant growth and was therefore further investigated. Because tripartite plantbacteria-fungi interactions can improve phytoremediation, the inoculum was coinoculated on hybrid poplar with the chlorendic acid degrading fungal strain Penicillium canescens 1D-2a. No positive effects neither on plant growth nor on degradation of chlorendic acid were detected. However, the conditions of plant growth during this experiment were not optimal, leading to symptoms of stress even in the non-exposed control plants. Moreover, it was observed that fungal degradation of chlorendic acid in soil depended on environmental factors. This experiment should therefore be repeated under more optimal conditions. In addition, the environmental conditions for optimal fungal chlorendic acid degradation in soil should be taken into account. In conclusion, microorganisms were isolated from a chlorendic acid polluted field that can degrade this highly chlorinated organic pollutant. Our results indicate that highly recalcitrant, seemingly non-biologically degradable organic pollutants can be remediated by using biological approaches. This is promising for bioaugmented phytoremediation of highly chlorinated, recalcitrant organic pollutants. However, before implementation in the field, further optimization is still required. The potential advantages of beneficial plant-bacteria-fungi interactions should be explored more in detail.

Chlorendisch zuur is een hoog gechloreerde, recalcitrante organische verbinding, die resistent lijkt te zijn tegen biologische afbraak. Tot op heden werden nog geen micro-organismen beschreven die chlorendisch zuur kunnen afbreken. Deze thesis heeft als doel om de mogelijkheden tot biologische remediatie van recalcitrante organische polluenten, zoals chlorendisch zuur te onderzoeken. Hiervoor werden de gemeenschappen van bacteriën en fungi eigen aan een chlorendisch zuur vervuilde site bestudeerd voor hun eventuele toepassing in bio- en fytoremediatie van chlorendisch zuur. Het is van groot belang om eerst de gevolgen van een vervuiling met een organische verbinding op de natuurlijke microbiële gemeenschappen te begrijpen. Daarom werden in het eerste deel van deze thesis de effecten van chlorendisch zuur op van nature voorkomende gemeenschappen van bacteriën en fungi in bodem onderzocht. Daarnaast werden ook de effecten van bodemdiepte geëvalueerd. Chlorendisch zuur heeft meer uitgesproken effecten op de bacteriële diversiteit dan bodemdiepte, terwijl voor fungi het omgekeerde waargenomen werd; bodemdiepte had een groter effect op de diversiteit aan fungi. Deze resultaten wijzen op een hogere tolerantie aan chlorendisch zuur van de aanwezige fungi gemeenschappen dan de bacteriële gemeenschappen. Beide gemeenschappen bevatten echter taxa die talrijker voorkomen in sterker vervuilde bodem, wat suggereert dat zowel fungi als bacteriën onderzocht dienen te worden voor hun potentieel tot afbraak van chlorendisch zuur. Ook bodemdiepte selecteerde voor verschillende taxa. Daarom is het van groot belang om tijdens in situ bio-augmentatie rekening te houden met de diepte waarop men inoculeert, dit om een succesvolle vestiging van de geïnoculeerde stammen in van nature voorkomende gemeenschappen te verzekeren. Deze resultaten geven ons een beter inzicht van de effecten van bodemdiepte en vervuiling met chlorendisch zuur op de natuurlijk voorkomende bodemgemeenschappen van bacteriën en fungi. Hiermee moet rekening worden gehouden bij het selecteren van de meest geschikte stammen voor in situ bioremedatie. In het tweede deel werden de van nature aanwezige gemeenschappen aan bacteriën en fungi op de gecontamineerde site onderzocht voor hun capaciteiten tot afbraak van chlorendisch zuur. Zowel bacteriën als fungi die chlorendisch zuur konden afbreken werden geïdentificeerd. De afbraakcapaciteit van de geïsoleerde fungi was echter veel hoger dan die van de bacteriën. Productie van hydroxyl radicalen door fungi via Fenton reacties is het voorgestelde mechanisme van afbraak. Vanwege de lage substraat specificiteit van hydroxyl radicalen, kunnen de geïsoleerde chlorendisch zuur afbrekende stammen ook interessant zijn voor toepassing in bioremediatie van andere organische polluenten. Penicillium canescens 1D-2a, kon in 28 dagen tot 55% van het origineel in een bodem aanwezige chlorendisch zuur verwijderen. De geïsoleerde bacteriën werden verder onderzocht voor hun mogelijkheden om de plantengroei te bevorderen. In vitro testen voor eigenschappen die de plantengroei kunnen bevorderen leverden in alle 330 isolaten positieve resultaten op. In planta kon echter geen significante verbetering van de plantengroei waargenomen worden. Eén bacterieel consortium, bestaande uit Kocuria rhizophila 121, Bacillus sp. 118, Acinetobacter sp. 323, Dyella japonica 288 en Sphingomonas sp. 244 leek echter wel een positieve invloed te hebben op de plantengroei en werd daarom verder onderzocht via co-inoculatie in populier met de chlorendisch zuur afbrekende fungus Penicillium canescens 1D-2a. Op deze manier konden ook eventuele gunstige plant-bacterie-fungi interacties geëvalueerd worden, aangezien deze drieledige interacties de efficiëntie van fytoremediatie kunnen bevorderen. Er werden echter geen significante effecten van de inoculatie op de planten groei of de afbraak van chlorendisch zuur in bodem vastgesteld. Bovendien vonden we dat de afbraak van chlorendisch zuur in bodem door de fungus duidelijk afhankelijk was van omgevingsfactoren. Vanwege de niet-optimale condities voor plantengroei tijdens dit experiment, zou het experiment herhaald moeten worden in meer optimale condities, ook rekening houdend met de optimale omgevingsparameters voor afbraak van chlorendisch zuur door de fungus. Dit onderzoek toont aan dat er op een met chlorendisch zuur vervuilde site micro-organismen aanwezig zijn, die deze recalcitrante organische verbinding kunnen afbreken. Dit biedt perspectief voor toepassingen in bio-geaugmenteerde fytoremediatie van chlorendisch zuur door inoculatie met chlorendisch zuur afbrekende microbiële consortia. Bovendien toont deze studie ook dat recalcitrante organische polluenten die op het eerste zicht niet bioafbreekbaar blijken te zijn, toch geremedieerd kunnen worden gebruik makend van biologisch gebaseerde technieken. Verder onderzoek is echter nodig vooraleer kan worden overgegaan naar toepassingen in het veld; hierbij dienen ook de mogelijke voordelige plant-bacterie-fungi interacties verder onderzocht te worden.