Site-specific protein functionalization by expressed protein ligation for advanced biomaterials

Abstract

Nowadays, bioactive materials are mainly produced by the biofunctionalization of substrates based on non-specific coupling of proteins. The consequence of this approach is that due to the random orientation and the potentially associated structure disruption, part of the proteins will have an inaccessible active site. This has a negative effect on the sensitivity, selectivity and reproducibility of the final bioactive device. Site-specific modification of proteins circumvents these issues. This thesis describes the use of expressed protein ligation (EPL) as a protein engineering technique for the site-specific alkynation of maltose binding protein (MBP) and nanobody BcII10 (NbBcII10). The C-terminally attached alkyne functionality can then be further used for copper (I)-catalyzed azide alkyne cycloaddition click chemistry. First, the site-specific alkynation of MBP was investigated as a proof of concept. Site-specific alkynation by means of EPL, requires a bifunctional linker that contains an alkyne group and a nucleophile that is able to react with the thioester function that is formed during the EPL process. As a bifunctional linker, 2-amino3-mercapto-N-(prop-2-yn-1-yl)propanamide was synthesized containing an alkyne and thiol functionality. Using this linker, site-specifically alkynated MBP was produced with a yield of almost 22 mg/L culture. The presence of the alkyne functionality was successfully demonstrated by means of western blotting. In addition to the site-specific alkynation, random alkynation was also performed. For both alkynated MBP variants, the clickability was evaluated using in situ ellipsometry. Two different coupling protocols were investigated: the DIP method, where a silicon surface is submerged in a protein solution, and the DROP method where only one drop of protein solution is used for the functionalization of the surface. Both protocols resulted in the coupling of a reasonable amount of alkynated MBP to the surface, for both the site-specifically alkynated and the randomly alkynated MBP. By means of the the DROP method, combined with a high concentration of sodium ascorbate, THPTA and copper catalyst, sitespecifically alkynated MBP was coupled in an oriented way with a minimum of protein waste resulting in a very cost-efficient immobilization protocol. A disadvantage of using thiol-based bifunctional linkers, like 2-amino-3-mercaptoN-(prop-2-yn-1-yl)propanamide, is the subsequent introduction of a free thiol into the protein. This free thiol can cause unwanted side reactions, e.g. interference with endogenous cysteines and formation of disulphide bridges to form dimers. In this thesis, the synthesis and use of an amine-based bifunctional linker, 2- hydrazinyl-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide, was investigated for the site-specific alkynation of MBP. In this way the free thiol can be avoided. The first results, after a click reaction in solution with azide functionalized biotin were very promising and proved the clickability of MBP that was alkynated using the amine-based bifunctional linker. Nevertheless, ESI-MS showed that the main part consisted of hydrolyzed MBP instead of alkynated MBP. In other words, only a very minor part of the protein solution was actually alkynated. Attempts in protocol optimization did not result in an increase of the amount of alkynated MBP. The method was also evaluated on another protein, namely nanobody BcII10 (NbBcII10), but the results were similar. The main goal of this thesis research was the site-specific modification of nanobodies, in particular NbBcII10. In general, nanobodies are expressed in the periplasm of E.coli. The periplasm has an oxidizing environment, which enables a correct protein folding. EPL constructs are generally expressed in the cytoplasm. In this thesis, various strategies for the periplasmic expression of EPL constructs were assessed. Therefore, several constructs were developed containing different leader sequences for periplasmic transport using two different pathways, i.e. the Sec pathway (leader sequences pelB, OmpA, OmpF and malE) and the SRP pathway (leader sequences DsbA and TolB). The constructs were expressed in E. coli BL21(DE3) and E. coli Lemo21(DE3) but even after enrichment of the protein extract, the expressed intein protein complex (NbBcII10-intein-CBD) could not be found in the periplasmic extract. As an alternative for periplasmic extraction, cytoplasmic expression and extraction was evaluated by using SHuffle®T7 cells and the addition of a small peptide spacer (LEY) at the C-terminus of the Nb, both of which promote a correct protein folding in the cytoplasm. ELISA and SPR experiments showed that fully functional NbBcII10-LEY-alkyne was produced through cytoplasmic expression and alkynation by EPL. This demonstrates that periplasmic extraction is not (always) a must for nanobodies to become/remain active (correctly folded) after expression and that post-translational alkynation by EPL does not influence the binding activity of the NbBcII10. Finally, by strategic design of the bifunctional linker, every possible ‘click’ group can in principle be site-specifically attached to proteins. By doing this, a sitespecifically modified protein can be coupled in a covalent and oriented way in order to improve the accessibility of the protein’s active region.

Nog steeds worden bioactieve materialen voornamelijk geproduceerd door het biofunctionaliseren van substraten aan de hand van een niet-specifieke eiwit koppeling. Het gevolg van deze aanpak is een willekeurige oriëntatie en een potentiële structurele beschadiging van (delen van) het eiwit met een onbereikbare of niet-functionele actieve plaats als gevolg. Dit heeft een negatief effect op de sensitiviteit, selectiviteit en reproduceerbaarheid van de finale applicatie. Plaatsspecifieke modificatie van eiwitten kan deze problemen voorkomen. Deze thesis beschrijft het gebruik van de “expressed protein ligation” (EPL) methode als een eiwit modificatie techniek voor de plaatsspecifieke alkynering van “maltose binding protein” (MBP) en het nanobody BcII10 (NbBcII10). De C-terminaal gekoppelde alkyn functionaliteit kan dan vervolgens gebruikt worden in klik chemie, nl. voor koper(I) gekatalyseerde azide alkyn cycloadditie reacties. Ter illustratie van bovengenoemd concept werd eerst de plaatsspecifieke alkynering van MBP onderzocht. Plaatsspecifieke alkynering met behulp van EPL vereist een bifunctionele linker die een alkyn groep en een nucleofiel bevat. Het nucleofiel kan dan reageren met de thioester functie die wordt gevormd tijdens het EPL proces. Als bifunctionele linker werd 2-amino-3-mercapto-N-(prop-2-yn1-yl)propanamide gesynthetiseerd. Door gebruik te maken van deze linker werd plaatsspecifiek gealkyneerd MBP via EPL geproduceerd met een opbrengst van 22 mg/L cultuur. De aanwezigheid van de alkyn functionaliteit werd succesvol aangetoond door middel van western blotting. Daarnaast werd ook willekeurig gealkyneerd MBP aangemaakt. Voor beide gealkyneerde MBP varianten werd de klikbaarheid geëvalueerd door middel van in situ ellipsometrie. Twee verschillende koppelingsprotocols werden onderzocht: de DIP methode waarbij het silicium substraat wordt ondergedompeld in een eiwitoplossing en de DROP methode waarbij slechts één druppel van de eiwitoplossing wordt gebruikt voor de functionalisatie van het oppervlak. Beide protocols resulteren in de covalente koppeling van een redelijke hoeveelheid gealkyneerd MBP aan het oppervlak voor zowel het plaatsspecifiek gealkyneerd als het willekeurig gealkyneerd MBP. Door gebruik te maken van de DROP methode, gecombineerd met een hoge concentratie van natriumascorbaat, THPTA en een koper katalysator, werd plaatsspecifiek gealkyneerd MBP op een georiënteerde manier gekoppeld met een minimum aan eiwitverlies resulterend in een zeer kostenefficiënte immobilisatie procedure. Een nadeel van thiol-gebaseerde bifunctionele linkers zoals 2-amino-3-mercaptoN-(prop-2-yn-1-yl)propanamide is de introductie van een vrije thiol functie in het eiwit. Dit vrije thiol kan ongevraagde nevenreacties veroorzaken zoals interferentie met thiol groepen van endogene cysteines, de vorming van disulfide bruggen en dimeren. In deze thesis werd de synthese en het gebruik van de amine-gebaseerde bifunctionele linker 2-hydrazinyl-N-(prop-2-yn-1-yl)acetamide onderzocht voor de plaatsspecifieke alkynering van MBP. Op deze manier wordt de aanwezigheid van een vrije thiol na de alkynering voorkomen. De eerste resultaten van een klikreactie in oplossing met azide gefunctionaliseerd biotine waren veelbelovend en bewezen de klikbaarheid van MBP dat gealkyneerd werd door gebruik te maken van de amine-gebaseerde bifunctionele linker. Desalniettemin, toonde ESI-MS aan dat het grootste deel van het MBP gehydrolyseerd was in plaats van gealkyneerd. Met andere woorden, slechts een kleine fractie van de eiwitoplossing was daadwerkelijk gealkyneerd. Pogingen tot optimalisatie van de procedure resulteerde niet in een stijging van de hoeveelheid gealkyneerd MBP in de eiwitoplossing. Deze methodes werden eveneens geëvalueerd met een ander eiwit, het nanobody BcII10 (NbBcII10), maar de resultaten waren vergelijkbaar. De voornaamste doelstelling van het onderzoek in deze thesis was de plaatsspecifieke modificatie van nanobodies, in het bijzonder NbBcII10. In het algemeen worden nanobodies gevouwen in en geëxtraheerd vanuit het periplasma van E. coli. Het periplasma heeft een oxiderende omgeving die een correcte eiwitvouwing mogelijk maakt. EPL constructen echter, worden normaal in het cytoplasma tot expressie gebracht en geëxtraheerd uit het cytoplasma. In deze thesis werden verschillende strategieën voor de periplasmatische expressie van EPL constructen onderzocht. Hiertoe werden meerdere constructen ontwikkeld die verschillende signaalsequenties bevatten voor periplasmatisch transport gebruikmakend van 2 pathways, namelijk de SEC pathway (signaalsequenties pelB, OmpA, OmpF and malE) en de SRP pathway (signaalsequenties DsbA and TolB). De constructen werden tot expressie gebracht in E. coli BL21(DE3) en E. coli Lemo21(DE3) maar zelfs na opzuivering van het eiwitextract, met behulp van chitine, werd het NbBcII10-inteine-CBD complex niet terug gevonden in het periplasmatisch extract. Als alternatief voor de periplasmatische extractie werd de cytoplasmatische expressie en extractie onderzocht. Hierbij werd gebruik gemaakt van SHuffle®T7 cellen en een kort LEY peptide fragment tussen de Cterminus van het nanobody en de alkyn linker, beide ter promotie van een correcte eiwitvouwing. ELISA en SPR experimenten toonden aan dat volledig functioneel NbBcII10-LEY-alkyn kon aangemaakt worden door een cytoplasmatische expressie, alkynering via EPL en extractie. Dit toont aan dat een periplasmatische extractie niet altijd een must is voor nanobodies om actief te blijven na expressie en dat post-translationele alkynering via EPL geen invloed heeft op de bindingsactiviteit van het NbBcII10. Door het strategisch designen van de bifunctionele linker kan in principe elke mogelijke klik functie plaatsspecifiek op het eiwit gebonden worden. Door dit te doen kan het plaatsspecifiek gemodificeerd eiwit covalent en georiënteerd gekoppeld worden om op die manier de bereikbaarheid van de actieve regio te optimaliseren.