Two tools, one t(h)ale: Exploring excess Cu- and Cd-induced responses in Arabidopsis thaliana using two different resources, natural accessions and mutant lines

Abstract

Commonly known as thale cress, Arabidopsis thaliana is the most intensively studied species in fundamental research on plant biology. Although often considered a weed and with little commercial value, its status as a molecular and genetic model plant is maintained by an active cooperative research community. It is further supported by a large collection of mutant lines and genomic resources such as natural accessions, which result from the unique selective pressures associated to the A. thaliana subcosmopolitan distribution. Whereas the considerable number of mutant lines makes Arabidopsis a unique target for functional identification and analysis of genes and gene products, natural accessions can be important genetic tools in studying adaptation to adverse environmental conditions. Together, these different genetic tools can facilitate the study of plant responses to metal stress. Toxic metal contamination of soils is a worldwide problem primarily caused by anthropogenic activities. While several metals are fundamental for normal plant development, high bioavailable metal concentrations in the soil often induce toxicity responses that ultimately inhibit plant growth. For example, copper (Cu) is a redox-active micronutrient essential for normal plant development. In excess, it can interfere with cellular and metabolic processes and directly induce oxidative stress. Exposure to non-essential phytotoxic elements, such as cadmium (Cd), also affects several cellular processes, but indirectly induces oxidative stress e.g. by interfering with antioxidative response mechanisms. Moreover, exposure to Cd is also known to disturb the homeostasis of essential elements such as Cu, which in turn enhances the toxic effects of Cd. The first main objective of the current work was to investigate and compare the plant growth, metal concentration and translocation, metabolic and transcriptomic responses in roots (Chapter 4) and leaves (Chapter 5) of two different natural accessions. More specifically, Columbia (Col-0, the reference genome) and Wassilewskija (Ws) accessions were exposed to toxic sublethal concentrations of Cu and Cd (respectively 2 µM and 5 µM) for 24 and 72 h. Accession-specific sensitivities to excess Cu and Cd were observed, confirming previous reports that Ws plants are less sensitive to excess Cu and Cd than Col0 plants. Moreover, our results indicate that, under control conditions, Col-0 and Ws plants favor different life strategies (Chapter 5). Whereas Col-0 plants invest in detoxification responses related to oxidative stress, signaling, and antioxidative defense mechanisms, Ws plants primarily invest in a constitutively efficient metal homeostasis (Chapter 5). We propose that the ability of Ws plants to better counteract alterations to Cu homeostasis culminates in these plants being less sensitive to excess Cu and Cd than Col-0 plants. This is supported by a more efficient modulation of Cu uptake and distribution to minimize Cu toxicity in Ws plants as compared to Col-0 plants (Chapter 4). The Ws accession is also able to rapidly counteract Cd-induced Cu deficiency-like responses characterized by increased Cu uptake and reallocation of intracellular Cu to essential cuproproteins (Chapter 4 and 5). In turn, our results suggest that Col-0 plants favor the activation of detoxification responses after exposure to excess Cu and Cd, which involve antioxidative defense mechanisms (Chapter 4 and 5) and oxidative stress signaling (Chapter 5). The second main objective of the current work was to investigate oxidative signaling via the OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE KINASE 1 (OXI1) downstream targets, functions, and interactions during Cu (Chapter 6) and Cd stress (Chapter 7). Therefore, plant growth, metal translocation, metabolic and transcriptomic responses were analyzed in wild-type (WT) and oxi1 knockout A. thaliana plants after metal exposure (2 µM Cu or 5 µM Cd) for 24 and 72 h. More than just toxic byproducts of aerobic metabolism, reactive oxygen species (ROS) are also important secondary messenger molecules and key regulators of adaptation responses to environmental stimuli. The protein kinase OXI1 plays a central role in the ROS signal transduction pathway by linking ROS production to downstream responses under metal stress. Although Col-0 plants favor the activation of detoxification-related oxidative stress signaling after exposure to excess Cu and Cd (Chapter 5), the loss of OXI1 function resulted, within this experimental timeframe, in Col-0 oxi1 mutants being less sensitive to both Cu- (Chapter 6) and Cd-induced (Chapter 7) oxidative stress than WT plants. Our results validate the transcription factor ZAT12 as a downstream target of OXI1 in Cd-exposed roots. Interestingly, these results also allude to the activation of OXI1-independent signaling pathways that eventually bypass the absence of OXI1-regulated ZAT12 expression. Possible roles for OXI1 in the regulation of Cd-induced SPL7-mediated Cu deficiency-like responses in Col-0 plants and of metal-induced phytohormone signaling in WT plants are discussed. Considering that plant responses to metal stress are complex and involve diverse cellular and molecular processes, this study focused on investigating aspects and response mechanisms well established in our research group. Therefore, the timeframe and framework of this study provides only a glimpse into the responses of two A. thaliana natural accessions and two genotypes to excess Cu and Cd. Ultimately, long-term exposure and a whole genome approach are necessary to fully capture the details underlying the accessionand genotype-specific responses to excess Cu and Cd.

Arabidopsis thaliana, algemeen gekend als Zandraket, is het best bestudeerde modelorganisme in het fundamenteel onderzoek bij planten. Ondanks het feit dat het als onkruid beschouwd wordt en geen commerciële waarde heeft, is het een moleculaire en genetische modelplant. Dit wordt ondersteund door een grote beschikbaarheid aan mutanten maar ook aan natuurlijke accessies die het resultaat zijn van unieke selectiedruk geassocieerd met de subcosmopolitische distributie van A. thaliana. Terwijl het aanzienlijke aantal mutanten ervoor zorgt dat Arabidopsis uiterst geschikt is voor functionele identificatie en analyse van genen en genproducten, kunnen natuurlijke accessies belangrijke genetische hulpmiddelen zijn bij het bestuderen van adaptatie aan ongunstige omgevingsomstandigheden. Samen kunnen deze verschillende genetische instrumenten de studie van reacties van planten op metaalstress vergemakkelijken. Toxische metaalverontreiniging van bodems is een wereldwijd probleem dat hoofdzakelijk wordt veroorzaakt door antropogene activiteiten. Hoewel verschillende metalen van fundamenteel belang zijn voor de normale ontwikkeling van planten, induceren verhoogde biologisch-beschikbare metaalconcentraties in de bodem vaak toxiciteitsreacties die uiteindelijk de groei van planten remmen. Koper (Cu) is bijvoorbeeld een redox-actief micronutriënt dat essentieel is voor de normale ontwikkeling van planten. Bij overmaat kan het echter interfereren met cellulaire en metabole processen en rechtstreeks oxidatieve stress veroorzaken. Blootstelling aan niet-essentiële fytotoxische elementen, zoals cadmium (Cd), beïnvloedt ook verschillende cellulaire processen, maar induceert onrechtstreeks oxidatieve stress, bijvoorbeeld door te interfereren met het antioxidatief verdedigingssysteem. Bovendien is geweten dat blootstelling aan Cd de homeostase van essentiële elementen zoals Cu verstoort, wat op zijn beurt de toxische effecten van Cd versterkt. De eerste hoofddoelstelling van dit werk was het onderzoeken en vergelijken van de plantengroei, metaalconcentratie en -translocatie, metabole en transcriptionele responsen in wortels (Hoofdstuk 4) en bladeren (Hoofdstuk 5) van twee verschillende natuurlijke accessies. In het bijzonder werden de Columbia (Col-0, het referentiegenoom) en Wassilewskija (Ws) accessies gedurende 24 en 72 uur blootgesteld aan toxische, maar sublethale concentraties van Cu en Cd (respectievelijk 2 μM en 5 μM). Er werden accessiespecifieke gevoeligheden voor deze verhoogde blootstelling aan Cu en Cd waargenomen, die overeenstemden met eerdere rapporten waarbij werd aangetoond dat Ws planten minder gevoelig zijn dan Col-0 planten voor Cu- en Cd-stress. Bovendien geven onze resultaten aan dat, onder normale omstandigheden, Col-0 en Ws planten verschillende overlevingsstrategieën verkiezen (Hoofdstuk 5). Terwijl Col-0 planten investeren in detoxificatiereacties met betrekking tot oxidatieve stress, signalering en antioxidatieve verdedigingsmechanismen, investeren Ws planten voornamelijk in een constitutief efficiënte metaalhomeostase (Hoofdstuk 5). Het vermogen van Ws planten om veranderingen in Cu-homeostase beter te controleren, resulteert bovendien in het feit dat deze planten minder gevoelig zijn voor verhoogde Cuen Cd-concentraties dan Col-0 planten. Dit wordt ondersteund door een betere regulatie van Cu-opname en -verdeling om Cu-toxiciteit te minimaliseren in Ws planten in vergelijking met Col-0 planten (Hoofdstuk 4). De Ws accessie is ook in staat om Cd-geïnduceerde Cu-deficiëntie-gerelateerde responsen, gekenmerkt door verhoogde Cu-opname en reallocatie van intracellulair Cu naar essentiële cupro-proteïnen, efficiënt te reguleren (Hoofdstuk 4 en 5). Onze resultaten suggereren op hun beurt dat Col-0 planten detoxificatiereacties met daarbij het antioxidatief verdedigingssysteem (Hoofdstuk 4 en 5) alsook oxidatieve stress signalering (Hoofdstuk 5) onmiddellijk activeren na blootstelling aan verhoogde Cu- en Cd-concentraties. De tweede hoofddoelstelling van dit werk was om meer inzicht te verwerven in deze oxidatieve signalering door gebruik te maken van OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE KINASE 1 (OXI1) genmutanten om op die manier specifieke targets, functies en interacties tijdens Cu- (Hoofdstuk 6) en Cd-stress (Hoofdstuk 7) te onderzoeken. Hiervoor werden wild-type (WT) en oxi1 knockout A. thaliana planten opgekweekt en blootgesteld aan metalen (2 μM Cu of 5 μM Cd) gedurende 24 en 72 uur. Vervolgens werden de plantengroei, metaaltranslocatie, metabole en transcriptionele responsen geanalyseerd. Reactieve zuurstofsoorten (ROS) zijn meer dan alleen toxische bijproducten van het aëroob metabolisme. Ze zijn ook belangrijke secundaire boodschappermoleculen en regulatoren voor organismen om zich aan te passen aan omgevingsstimuli. Het proteïnekinase OXI1 speelt een centrale rol in de ROS-signaaltransductieroute door de ROS-productie te koppelen aan stroomafwaartse responsen onder metaalstress. Hoewel Col-0 planten oxidatieve stress signalering en bijbehorende responsen onmiddellijk activeren na blootstelling aan verhoogde Cu- en Cd-concentraties (Hoofdstuk 5), resulteerde het verlies van OXI1-functionaliteit, binnen het experimentele tijdsbestek, in minder gevoelige Col-0 oxi1 mutanten dan WT planten voor zowel Cu- (Hoofdstuk 5) als Cd-geïnduceerde (Hoofdstuk 6) oxidatieve stress. Verder valideren onze resultaten de transcriptiefactor ZAT12 als een stroomafwaarts doelwit van OXI1 in aan Cd-blootgestelde wortels. Interessant is dat deze resultaten ook aanwijzingen geven naar de activering van OXI1-onafhankelijke signaalroutes die uiteindelijk de afwezigheid van OXI1-gereguleerde ZAT12- expressie omzeilen. Mogelijke rollen voor OXI1 bij de regulatie van door Cdgeïnduceerde SPL7-gemedieerde Cu-deficiëntie-gerelateerde responsen in Col-0 planten alsook van metaalgeïnduceerde fytohormoonsignalering in WT planten worden in dit kader besproken. Gezien het feit dat plantenresponsen op metaalstress complex zijn en diverse cellulaire en moleculaire processen omvatten, richtte deze studie zich op het meer in de diepte onderzoeken van plantresponsen die reeds bestudeerd zijn in onze onderzoeksgroep. Daarom geeft het raamwerk van deze studie slechts een beperkte kijk op de responsen van twee A. thaliana natuurlijke accessies en twee genotypen na blootstelling aan verhoogde Cu- en Cd-concentraties. In de toekomst zijn een langetermijnblootstelling en een benadering gebaseerd op het volledige genoom noodzakelijk om meer details bloot te leggen die ten grondslag liggen aan de accessie- en genotype-specifieke responsen op Cu- en Cd-blootstelling.