HDAC and Timp-1 modulation after spinal cord injury

Abstract

SCI is a devastating pathology with major influence on patient’s quality of life and with an enormous economic impact. Possible therapeutic strategies are under investigation in clinical trials, although major breakthroughs still request some time and research questions remain. Hence, currently no therapeutic intervention leads to functional recovery. Therefore, pre-clinical research is still important to find new potential therapeutic targets in the SCI pathology. For the future, several therapeutic strategies should be combined to address all the multifactorial aspects of SCI. The primary injury, meaning the impact, is followed by the secondary injury caused by the chronic inflammatory response, the inhibitory molecules produced by reactive glia and glial scar formation. These secondary processes create a non-permissive environment for neuroregeneration. Treatment modalities should focus on reducing these secondary responses to make the perilesional environment prone to neuroregeneration. A potential therapeutic strategy to modulate these secondary processes is the use of HDAC inhibitors, as described in chapter 2. These inhibitors have been shown to act immunomodulatory and neuroregenerative in several CNS injury models. In addition, HDAC inhibition with the broad-acting class I inhibitor VPA improved functional recovery after contusion SCI. However, to avoid side effects and to further elucidate which class I HDAC is responsible for these effects, our goal was to test specific HDAC inhibitors after SCI. HDAC3 has been identified to be a key regulator in macrophage polarization. Therefore, in chapter 3 we hypothesized that HDAC3 inhibition, using two inhibitors: scriptaid and RGFP966, modulates the perilesional environment by inducing an anti-inflammatory milieu that improves functional recovery after SCI. Indeed, our results demonstrate that specific HDAC3 inhibition, with RGFP966, promotes altenatively activated macrophages and reduces foamy macrophages in vitro. However, in vivo HDAC3 inhibition did not improve functional recovery after T-cut hemisection SCI. Furthermore, in chapter 4 we studied the effect of HDAC8 inhibition after SCI. Previous studies showed that HDAC8 inhibition reduces pro-inflammatory cytokine secretion by monocytes. Therefore, our hypothesis was that HDAC8 inhibition with PCI-34051 reduces the activation of pro-inflammatory macrophages and thereby improves functional recovery after SCI. In vitro analyzes of M1 and M2 markers displayed no effects of HDAC8 inhibition on macrophage phenotype. In addition, our in vivo experiment showed that neither PCI-34051 nor VPA had an effect on functional recovery after T-cut hemisection SCI. We showed that HDAC3 inhibition promotes alternatively activated macrophages and reduces foamy macrophages in vitro. However, it did not improve functional recovery after SCI in the T-cut hemisection model, in contrast to previously published results in contusion SCI. Furthemore, we showed that neither HDAC8 inhibition nor broad class I HDAC inhibition with VPA had an effect on functional recovery in the T-cut hemisection model. VPA has been shown before to improve functional recovery after contusion and compression SCI models. Possible explanations for these conflicting data are the presence of spared fibers in contusion/compression SCI models or the difference in injury severity. TIMP-1 modulation was examined as another approach to modulate the secondary response after SCI. TIMP-1 inhibits MMP-9, which contributes to BSCB disruption and immune cell infiltration. In addition, TIMP-1 has been shown to be neuroprotective and to have anti-apoptotic effects. Moreover, we previously demonstrated that it is induced by OSM, and that OSM has neuroprotective effects and improves functional recovery after SCI. Hence, in chapter 5 we hypothesized that TIMP-1 can improve functional recovery after SCI. We show that TIMP-1 KO mice display decreased functional recovery, which is in line with our hypothesis. However, the histological analyzes showed no differences between TIMP-1 KO mice and wildtype control mice in lesion size, astrogliosis, demyelinated area, immune cell infiltration, macrophage phenotype and serotonergic fiber regrowth and in number of serotonergic fibers. In addition, we proposed that local treatment with rTIMP-1 improves functional recovery after SCI, although our in vivo results showed that rTIMP-1 had no effect. To summarize, our results indicate that endogenous TIMP-1 plays an important role after SCI. However remaining research questions need to be answered in order to understand the underlying mechanisms. In conclusion, in this thesis, we point out that class I HDAC inhibition might stimulate spared fiber regeneration and induces functional recovery depending on the SCI model. We show that the absence of TIMP-1 reduces functional recovery which highlights its importance in the pathology and the resolution of SCI. Further research needs to reveal its level of action in the secondary injury processes. Addressing the remaining research questions will lead to a better understanding of the SCI pathology and will reveal additional targets for experimental therapies to be able to treat patients in the future.

Ruggenmergschade is een ernstige aandoening die een enorme invloed heeft op de levenskwaliteit van de patiënt en daarnaast ook een grote financiële impact heeft. Huidige klinische studies hebben nog niet tot een grote doorbraak geleid. Tot op heden is er dus geen geneesmiddel beschikbaar dat leidt tot functioneel herstel. In de toekomst zullen meerdere strategieën gecombineerd moeten worden om functioneel herstel te bevorderen omdat de pathologie van een dwarslaesie vele facetten heeft. De initiële schade wordt namelijk gevolgd door secundaire schade. Deze secundaire schade wordt voornamelijk veroorzaakt door een chronische ontstekingsreactie, blokkerende moleculen die geproduceerd worden door actieve astrocyten en de vorming van een actief litteken. Deze processen creëren een omgeving rondom die laesie, die herstel en uitgroei van neuronen en axonen niet toelaat. Toekomstige therapieën moeten focussen op de secundaire processen om de omgeving in de ruggenmerg na schade te veranderen zodat deze herstel van neuronen en uitgroei van axonen stimuleert. Een mogelijke therapeutische strategie om deze processen te veranderen is het gebruik van histon deacetylase (HDAC) inhibitoren, wat beschreven werd in hoofdstuk 2. Eerdere studies hebben aangetoond dat deze inhibitoren immuun-modulerend zijn en regeneratie van neuronen stimuleren in verschillende modellen van centrale zenuwstelsel-schade. Daarnaast heeft men al eerder aangetoond dat HDAC inhibitie met de algemene klasse I inhibitor VPA, functioneel herstel verbetert in een contusie ruggenmergschademodel. Echter, om de bijwerkingen van VPA te vermijden en verder uit te zoeken welke specifieke klasse 1 HDAC verantwoordelijk is voor de positieve effecten van HDAC-blokkering, was ons doel om specifieke HDAC inhibitoren te testen na ruggenmergschade. Eerder werd HDAC3 geïdentificeerd als een belangrijke factor voor de differentiatie van macrofagen naar een anti-inflammatoir fenotype (alternatief geactiveerde macrofagen). Daarom wilden we in hoofdstuk 3 onderzoeken of HDAC3 inhibitie, met twee inhibitoren: scriptaid en RGFP966, macrofagen omvormt naar het ontstekingsremmend fenotype om zo de omgeving rond de laesie te veranderen om functioneel herstel te stimuleren. Onze resultaten tonen aan dat specifieke HDAC3 inhibitie, met RGFP966, inderdaad alternatief geactiveerde macrofagen induceert in vitro maar dat het in vivo geen effect heeft op functioneel herstel na ons hemisectie muismodel. Vervolgens hebben we in hoofdstuk 4 het effect van HDAC8 inhibitie onderzocht na ruggenmergschade. Voorgaand onderzoek heeft immers aangetoond dat HDAC8 inhibitie pro-inflammatoire cytokines geproduceerd door monocyten verminderde. Onze hypothese was daarom dat HDAC8 inhibitie, met PCI-34051, pro-inflammatoire macrofagen vermindert en daardoor functioneel herstel verbetert. Onze resultaten toonden echter dat in vitro HDAC8 inhibitie geen effect heeft op de expressie van pro- of anti-inflammatoire macrofaagmerkers. Daarnaast, toonde het in vivo experiment ook dat geen van beiden, PCI-34051 en VPA, een effect hadden op functioneel herstel in ons hemisectie muismodel voor ruggenmergschade. Samengevat, tonen we aan dat HDAC3 inhibitie alternatief geactiveerde macrofagen induceerde, maar dat het geen effect had op functioneel herstel na ruggenmergschade. Dit resultaat is in contrast met eerder gepubliceerde resultaten in contusie SCI. Verder, hebben we aangetoond dat HDAC8 inhibitie en algemene klasse I HDAC inhibitie met VPA geen effect had op functioneel herstel in het hemisectie model voor ruggenmergschade. Voorheen werd ook reeds aangetoond dat VPA functioneel herstel kon verbeteren in contusie en compressie modellen voor ruggenmergschade. Mogelijks zijn effecten op overblijvende beschadigde zenuwvezels of het verschil in ernst van de schade redenen voor deze tegensprekende resultaten. Om een andere aanpak te gebruiken om de secundaire processen na ruggenmergschade te veranderen, werd TIMP-1 modulatie toegepast. TIMP-1 blokkeert MMP-9, dat bijdraagt aan de schade aan de bloedbaanruggenmerg barrière en immuuncel-infiltratie. Daarnaast werd ook reeds aangetoond dat TIMP-1 neuro-protectief kan zijn en apoptosis kan tegengaan. Eerder hebben wij aangetoond dat TIMP-1 geactiveerd wordt door OSM en dat OSM neuro-protectief is en functioneel herstel kan verbeteren na ruggenmergschade. In hoofdstuk 5 wilden we daarom aantonen dat TIMP-1 op zijn beurt functioneel herstel na ruggenmergschade kan bevorderen. Onze resultaten laten zien dat TIMP-1 knock-out muizen een verminderd functioneel herstel hebben, wat overeenstemt met de hypothese. De histologische analyzes hebben echter geen verschil aangetoond tussen de TIMP-1 knock-out muizen en de wildtype controle muizen in laesie grootte, astrogliose, het gedemyeliniseerde gebied, immuun cel-infiltratie, macrofaag fenotype en de groei en het aantal serotonerge vezels. Daarnaast hadden we verwacht dat lokale behandeling met recombinant TIMP-1 het functioneel herstel na SCI kon verbeteren, alhoewel dit geen effect bleek te hebben. Onze resultaten suggereren dat endogeen TIMP-1 een belangrijke rol speelt in de pathologie van ruggenmergschade maar overblijvende onderzoeksvragen dienen nog beantwoord te worden om de onderliggende mechanismen te begrijpen. In conclusie, in deze thesis belichtten we bevindingen die tonen dat klasse I HDAC inhibitie beschadigde zenuwvezels zou kunnen herstellen door de omgeving rondom het letsel te veranderen naar ontstekingsremmend wat functioneel herstel kan verbeteren, afhankelijk van het gebruikte muismodel. We toonden ook dat de afwezigheid van TIMP-1 functioneel herstel vermindert wat erop wijst dat TIMP-1 belangrijk is in de ziekteprocessen en in het verminderen van de schade na ruggenmergschade. Verder onderzoek is nodig om te onthullen hoe het in deze processen een rol speelt. Het beantwoorden van de overblijvende onderzoeksvragen kan leiden tot een beter begrip van de pathologie na ruggenmergschade en kan nieuwe doelwitten aanwijzen voor experimentele therapieën om in de toekomst patiënten te behandelen.