Analysis of native acetylcholine receptor-associated proteins in TE 671 cells

Abstract

Myasthenia Gravis (MG) is een auto-immuunziekte waarbij er auto-antilichamen gericht zijn tegen de acetylcholine receptor (AchR) of tegen muscle-specific kinase (MuSK) ter hoogte van de neuromusculaire junctie (NMJ). De auto-antilichamen induceren schade aan de postsynaptische membraan van de NMJ. Bij een klein aantal van de MG-patiënten worden noch antilichamen tegen AChR noch tegen MuSK teruggevonden. Het auto-antigen van deze seronegatieve patiënten is nog onbekend. Wanneer antilichamen interfereren met eiwitten die een belangrijke rol spelen in de stabiliteit of de maturatie van de NMJ, kan dit de moleculaire organisatie van de NMJ verstoren en symptomen van MG veroorzaken. Het doel van deze studie was om eiwitten die geassocieerd zijn met de AChR te karakteriseren om vervolgens kandidaat eiwitten te vinden voor de ongekende auto-antigenen in MG. De TE671 rhabdomyosarcoma cellijn werd gebruikt als alternatieve bron voor de NMJ om de eiwitten te bestuderen. Eerst werd de aanwezigheid van NMJ eiwitten in de TE671 cellen geanalyseerd door middel van Western blot experimenten. Antilichamen herkenden in het TE671 celextract veel eiwitten die geassocieerd zijn met de NMJ. Vervolgens werd de efficiëntie van milde detergenten om AChR uit de celmembraan op te lossen nagegaan met behulp van een radioimmunoassay. Dit experiment toonde aan dat lage concentraties van NP-40, triton-X100 en brij-97 de grootste hoeveelheden AChR oplosten. Daarna werden de AChR en AChR-geassocieerde eiwitten geprecipiteerd met alfa bungarotoxine (α-BT) en met anti-AChR IgG1-637 antilichamen. De geprecipiteerde eiwitten werden geïdentificeerd door gebruik te maken van immunoblotting met antilichamen en van massaspectrometrische analyses. De aanwezigheid van subeenheden van de AChR werd aangetoond door Western blot in de immunoprecipitatie-experimenten met IgG1-637. De massaspectrometrische analyses bevestigden de aanwezigheid van eiwitten van het cytoskelet en keratines in de stalen die geprecipiteerd werden met α-BT. Desondanks deze resultaten slechts weinig AChR complexen aantoonden in de geprecipiteerde stalen, geven ze aan welke verdere experimenten uitgevoerd dienen te worden om AChR-geassocieerde eiwitten te identificeren. -----

Myasthenia Gravis (MG) is an autoimmune disease characterised by auto-antibodies directed against the acetylcholine receptor (AchR) or the muscle-specific kinase (MuSK) at the NMJ. The postsynpatic membrane of the NMJ is the main target for the damage induced by the antibodies. A portion of MG patients neither have antibodies against the AChR nor to MuSK. The auto-antigen in these seronegative patients is still unknown. Antibodies interfering with proteins that play an important role in the stability or maturation of the NMJ might disturb the molecular organization of the NMJ and, thereby, cause myasthenic symptoms. The aim of this project was to characterize AChR associated proteins that can be a candidate for the unknown auto-antigens. To analyse the proteins of the NMJ, the TE671 rhabdomyosarcoma cel line was used as an alternative source for NMJ components. First, we analysed the presence of some NMJ proteins in the TE671 cells by immunoblotting experiments. Antibodies recognized many NMJ associated proteins in the TE671 cel extract. As a next step, we investigated the efficiency of mild detergent conditions in solubilizing the AChR from cell membrane by radioimmunoassay. Our experiments showed that low concentrations of the detergents NP-40, triton-X100 en brij-97 solubilized the best amounts of AChR. Subsequently, the AChR was precipitated together with AChR-associated proteins using alfa bungarotoxine (α-BT) and with the anti-AChR antibody IgG1-637. The precipitated proteins were identified by immunoblotting using antibodies and by mass spectrometry. The presence of AChR subunits was demonstrated by Western blot in the immunoprecipitation experiments with IgG1-637. Additionally the mass spectrometry analysis revealed the presence of cytoskeleton proteins and keratins in α-BT precipitated samples. Thus, although these results have, disappointingly, demonstrated little presence of AChR complexes in the precipitated samples, they do give clue about which further experiments could be performed to identified AChR proteins.