Zn transporters and their role in Zn homeostasis and tolerance mechanisms in the ectomycorrhizal fungus Suillus luteus.

Abstract

The ectomycorrhizal fungus Suillus luteus is a pioneer species that associates mutualistically with the roots of young pine trees. Zinc-tolerant ecotypes of this species have been isolated from zinc-polluted sites. Due to the high degree of zinc toxicity on these sites, organisms are subjected to a high selection pressure for adaptive zinc tolerance. Studies investigating adaptive zinc tolerance in S. luteus have reported that this fungal symbiont is able to protect its host plant from zinc stress. This feature makes the Suillus-Pinus association interesting for use in a phytostabilisation application for the remediation of zinc-polluted soils. Yet, in order to optimize such an application, more knowledge on the zinc toleramce mechanism and general zinc homeostasis in S. luteus is necessary. However, little is known about the molecular mechanism(s) and the genetic basis of the zinc tolerance trait. Since (1) zinc transporter are indispensable for maintaining Zn homeostasis in eukaryotes and (2) previous studies on zinc tolerance in S. luteus have indicated that zinc exclusion (likely transportermediated) is of major importance in conferring zinc tolerance to zinc-tolerant isolates, zinc transporters were inventoried in the S. luteus genome. Four CDF (Cation Diffusion Facilitator) and three ZIP (Zrt-, Irtlike Proteins) zinc transporters were identified in S. luteus. Phylogenetic analyses were performed to infer functional predictions to the identified transporter proteins. Two transporters of the ZIP family, SlZRT1 and SlZRT2, were further studied in chapter 2 and 3. Both transporters were predicted to function as plasma membrane-located zinc importers. Heterologous expression of SlZRT1 and SlZRT2 in a zinc-deficient yeast mutant confirmed these functional predictions. SlZRT1, which almost completely restored the phenotype of the yeast mutant, has a higher affinity for zinc than SlZRT2 and likely plays an important role in cellular zinc homeostasis in S. luteus. SlZRT2 on the other hand, has a much lower affinity for zinc and only marginally improved the growth of the yeast mutant. Subcellular localization of the SlZRT1::EFGP and SlZRT2::EGFP fusion proteins confirmed the predicted plasma membrane localization of the proteins. SlZRT2::EGFP fluorescence, however, was also observed in the membrane of the endoplasmatic reticulum. This could indicate a role for SlZRT2 in the cellular redistribution of zinc, rather than zinc uptake. Since a transceptor function (i.e. a transporter that also has a receptor function) is reported for the yeast transporters ScZRT1 and ScZRT2, this was also investigated for the S. luteus ZRT homologues, SlZRT1 and SlZRT2. For neither proteins a receptor function in addition to their transporter activity was observed. Two CDF transporters, SlZnT1 en SlZnT2, were further studied in chapter 4. Phylogenetic analysis revealed that the two transporters are most likely homologues of the Saccharomyces cerevisiae ScZRC1 vacuolar zinc importer. This function and localization were confirmed for SlZnT1 via heterologous expression in yeast. However, we were not able to express functional SlZnT2 in yeast. Both SlZnT genes are constitutively expressed in S. luteus and are not regulated by external Zn concentrations. Furthermore, a labile Zn pool was detected in the vacuoles of S. luteus free-living mycelium. It is therefore concluded that SlZnT1 is vital for maintenance of Zn homeostasis by transporting excess Zn into the vacuole. The main findings of a candidate gene study to identify the adaptive zinc tolerance mechanism in S. luteus are described in chapter 5. The expression of eigth genes (including SlZnT1, SlZnT2, and SlZRT1) with various roles in metal homeostasis and detoxification was analysed in a selection of five zinc-tolerant and five zinc-sensitive S. luteus isolates. SlZnT2 was identified in this initial screening as an interesting candidate gene for further study. SlZnT2 was subsequently studied in a larger sampling group consisting of thirthy S. luteus isolates with a broad range in zinc tolerance. A clear correlation between constitutive SlZnT2 transcript levels and zinc tolerance was observed in the thirty isolates (Pearson’s correlation r = 0.84; p < 0.0001). The expression of SlZnT2 explains 72% of the variation observed in zinc tolerance. Differences in SlZnT2 promoter sequences and gene copy numbers were observed among the isolates. These differences are suspected to underly the variation observed in constitutive SlZnT2 expression in S. luteus. Despite the strong correlation between SlZnT2 transcript levels and zinc tolerance, a functional characterization of SlZnT2 is necessary in order to infer causation between the two variables. Finally, in the last chapter, chapter 6, the major conclusions of this PhD project were summarized and discussed and outlooks and remarks for future studies are given. In general, it is concluded that: (1) S. luteus is a suitable ectomycorrhizal model organism, (2) that the knowledge on zinc homeostasis mechanisms in S. luteus is relevant and extrapolable to other species (wich is supported by phylogenetic analyses), (3) that the SlZnT2 gene, whose function and subcellular localization remain unclear, is likely involved in conferring zinc tolerance to zinc tolerant S. luteus isolates.

De ectomycorrhizaschimmel Suillus luteus is een pionierssoort die in symbiose samenleeft met de wortels van jonge dennnen. Zinktolerante ecotypes van deze soort zijn teruggevonden op zinkverontreinigde sites. De adaptieve zinktolerantie die geobserveerd wordt in deze ecotypes is het gevolg van een verhoogde selectiedruk door metaaltoxiciteit. Studies hebben aangetoond dat deze schimmels hun gastheerplanten kunnen beschermen tegen zinktoxiciteit. Het moleculaire mechanisme(n) verantwoordelijk voor de zinktolerantie, evenals de geassocieerde genetische determinant(en), zijn echter onbekend. Nochtans heeft de Suillus-Pinus associatie veel potentieel om gebruikt te worden in een bioremediatietoepassing. Voor de ontwikkeling van zulke toepassing is echter meer kennis vereist, zowel over het zinktolerantiemechanisme als over algemene zinkhuishouding in S. luteus. Aangezien (1) zinktransporters een zeer belangrijke rol spelen bij de homeostase van zink en (2) voorgaande studies hebben aangetoond dat zinktolerantie in S. luteus hoogstwaarschijnlijk berust op een zinkexclusiemechanisme, mogelijks transporter-gemedieerd, werd er een inventarisatie van alle zinktransporters in het genoom van S. luteus uitgevoerd. Vier CDF (Cation Diffusion Facilitator) en drie ZIP (Zrt-, Irt- like Proteins) zinktransporters werden geïdentificeerd in S. luteus. Fylogenetische analyses werden uitgevoerd om functionele voorspellingen over de desbetreffende transporters te bekomen. In hoofdstuk 2 en 3 worden twee transporters van de ZIP familie verder bestudeerd, namelijk SlZRT1 en SlZRT2. Van beide transporters was voorspeld dat ze gelokaliseerd zijn op het plasmamembraan en zink importeren in de cel. Functionele expressie van SlZRT1 en SlZRT2 in een zinkdeficiënte gistmutant bevestigde deze voorspellingen. SlZRT1 heeft een hogere affiniteit voor zink dan SlZRT2, herstelt het fenotype van de gistmutant bijna volledig, en speelt waarschijnlijk een zeer belangrijke rol in cellulaire zinkhomeostase in S. luteus. SlZRT2 heeft een veel lagere affiniteit voor zink, vertoont weinig zinkimportactiviteit en herstelt het fenotype van de gistmutant slechts minimaal. Lokalisatie van SlZRT1::EFGP en SlZRT2::EGFP fusieproteïnen in gist bevestigde voor beide transporters een lokatie in het plasma membraan. SlZRT2::EGFP fluorescentie werd daarnaast ook in het membraan van het endoplasmatisch reticulum geobserveerd. Dit zou kunnen wijzen op een primaire rol voor dit proteïne in de cellulaire redistributie van zink. Tenslotte werd in hoofdstuk 3 ook onderzocht of SlZRT1 en SlZRT2 kunnen fungeren als transceptors (transporters met ook een receptorfunctie), zoals is aangetoond voor de gisthomologen ScZRT1 en ScZRT2. Noch voor SlZRT1, noch voor SlZRT2 kon een receptorfunctie worden aangetoond. In hoofdstuk 4 worden 2 transporters van de CDF familie, SlZnT1 en SlZnT2, verder onderzocht. Fylogenetische analyse toonde aan dat beide transporters homologen zijn van de Saccharomyces cerevisiae ScZRC1 vacuolaire Zn importer. Deze locatie en functie konden bevestigd worden voor SlZnT1. Tot op heden blijven de functie en locatie van SlZnT2 echter onbekend. Vacuolaire opslag van Zn in S. luteus werd aangetoond met behulp van de fluorescente merker voor vrij zink FluoZin3. Er werd besloten dat SlZnT1 een belangrijk rol speelt in de detoxificatie van zink in S. luteus. In hoofdstuk 5 werd het zinktolerantiemechanisme van zinktolerante S. luteus isolaten verder onderzocht. De expressie van acht genen (waaronder SlZnT1, SlZnT2, en SlZRT1) met uiteenlopende rollen in metaalhomeostase en detoxificatie werd gescreend in een selectie van zinktolerante en zinksensitieve S. luteus stammen. Deze intiële screening duidde SlZnT2 aan als een interessant kandidaatgen voor verdere studie naar het zinktolerantiemechanisme. SlZnT2 werd verder onderzocht in een grotere studiepopulatie bestaande uit dertig S. luteus isolaten met een wijde spreiding in zinktolerantielevels. Er werd een duidelijke correlatie gevonden tussen SlZnT2 transcipt levels en zinktolerantie in S. luteus (Pearson’s correlatie r = 0.84; p < 0.0001). De expressie van SlZnT2 kon 72% van de variatie in zinktolerantie verklaren. Verschillen in SlZnT2 promotersequentie en genkopienummer werden vastgesteld. Deze observaties verklaren het verschil in constitutionele SlZnT2 expressie in S. luteus. Om aan te tonen dat de duidelijke associatie tussen SlZnT2 expressie en zinktolerantie ook een causaal verband heeft, is het echter nodig om SlZnT2 functioneel te karakteriseren. Ten slotte wordt er in het laatste hoofdstuk, hoofdstuk 6, een algemene samenvatting gegeven van de belangrijkste bevindingen van de studies uitgevoerd in dit doctoraatsonderzoek. Deze bevindingen worden bediscussieerd en een aantal toekomstperspectieven worden aangereikt. Algemene besluiten die getrokken worden zijn: (1) S. luteus is een goed ectomycorrhizaschimmel modelorganisme, (2) op basis van de fylogenetische analyses wordt verwacht dat de inzichten in de zinkhomeostasemechanismen van S. luteus extrapoleerbaar zijn naar vele andere soorten ectomycorrhizaschimmels, en (3) dat het SlZnT2 gen, waarvan noch de functie, noch de subcellulaire lokatie van achterhaald kon worden, waarschijnlijk verantwoordelijk is voor het zinktolerante fenotype van sommige S. luteus isolaten. Om deze hypothese te kunnen aantonen is echter een functionele karakterisatie van het gen noodzakelijk.