Clinical applications of proton-NMR derived metabolic phenotyping and metabolic imaging in non-small cell lung cancer

Abstract

Lung cancer is the leading cause of cancer death in men and the second leading cause of cancer death in women worldwide. It was estimated that 2.1 million new lung cancer cases and 1.8 million lung cancer death occur in 2018 worldwide, accounting for 18.4% of all cancer deaths. Metabolism encompasses the chemical processes that allow healthy cells to keep energy and redox balance steady, and it delivers building blocks required for cell development, survival and eventually proliferation. Cancer cells are well documented to rewire their metabolism and energy production networks to support rapid proliferation and survival in harsh conditions. Cancer related metabolic reprogramming has been recognized as one of the ten hallmarks of cancer. Despite the histologic and genetic heterogeneity of tumors, a common set of metabolic pathways sustain the high proliferation rates observed in cancer cells. Of special interest is the Warburg effect, i.e. glycolysis with production of lactic acid even in the presence of oxygen. Glycolytic intermediates support the production of precursors for the synthesis of lipids, nucleic acids and proteins to fulfill the metabolic needs of proliferating cells. In contrast with the initial hypothesis of Warburg, functional mitochondrial metabolism is critical for tumor growth. Increased glutamine uptake and glutaminolysis allow cancer cells to keep glutathione levels high and to replenish intermediates in the tricarboxylic acid (TCA) cycle that are redirected into biosynthetic reactions. In this thesis, the reader was introduced in the altered metabolism of lung cancer. Based on the plasma metabolic profile of lung cancer patients from the NCT02024113 of Louis et al., we evaluated the potential of the metabolic profile to discriminate between lung cancer and lung inflammation. This is of major importance as pulmonary imaging often identifies suspicious abnormalities resulting in supplementary invasive diagnostic procedures. Metabolic profiles of plasma from 347 controls, 269 cancer patients and 108 patients with inflammation were obtained by 1H-NMR spectroscopy. Models to discriminate between groups were trained by PLS-LDA. A LASSO approach was introduced to select the most differentiating variables (top K). A test set was used for independent validation. This study indicated that the classification model constructed with the top 16 variables results in an average MCE of 12%, a sensitivity of 89% and a specificity of 87%. As IR89 (glutamate) was selected in all the LASSO selections, its importance was further examined by its removal from the data, resulting in an increase of the MCE to 38% and a drop in sensitivity and specificity to 62%. This large increase in MCE demonstrated that glutamate strongly drives the classification. To examine the potential role of the relative glutamate concentration as a single diagnostic marker to differentiate between lung cancer and lung inflammation, we constructed a receiver operating characteristic (ROC) curve. The optimal cut-off point (0.31) for cancer diagnosis corresponded to a sensitivity of 85%, a specificity of 81%, and an AUC of 0.88. The PPV and NPV were 92% and 69%, respectively. The diagnostic value of PET-CT in patients with abnormal radiological findings was also investigated. The sensitivity, specificity, PPV and NPV of PET-CT for the diagnosis of lung cancer were 96%, 23%, 76% and 71% respectively. Due to this lower sensitivity (i.e. more false negative results), glutamate as a single marker was insufficient to exclude lung cancer. To overcome these limitations, we proposed to measure plasma glutamate in complement to PET-CT. In patients with both PET-positive lesions and low relative glutamate levels (suggestive for cancer), a tissue biopsy or resection seemed indispensable to obtain the histology and to guide further therapy. In case of a negative PET-CT and a high relative glutamate concentration, follow-up with CT but without invasive procedures seemed to be justified. Caution was advised in patients with conflicting results, i.e. PET-positive patients with a high glutamate concentration or PET-negative patients with a low relative glutamate concentration. In these patients a tissue biopsy or more intensive follow-up was recommended to exclude or confirm the presence of lung cancer since 19% of lung cancers remained undetected in this group. As described in our review, there is no universal metabolic phenotype of lung cancer. Hence, we focused on the investigation of potential relationships between the plasma metabolite concentrations and the glycolytic activity in the next chapter. 1H-NMR spectroscopy was employed to determine the relative metabolite concentrations in blood plasma of 222 patients with lung cancer. PET-CT resulted in standard uptake values (SUV), total body metabolic active tumor volumes (MATVWTB) and whole body total lesion glycolysis (TLGWTB) values. Patients were divided into low-value and high-value groups based on the median cut-off value of the PET parameter of interest. A univariate and multivariate OPLS-DA statistical analysis was performed to discriminate between lung cancer patients with high and low 18F-FDG uptake. It could be demonstrated by NMR metabolomics that a larger MATV and / or a higher TLG seems to be associated with a higher glucose plasma concentration, indicative for an increased gluconeogenesis in this group of lung cancer patients. This higher 18F-FDG uptake also corresponded with higher concentrations (and need) of non-carbohydrate glucose precursors such as glycerol and glucogenic amino acids (threonine, aspartate and valine) for which degradation of adipose tissue and muscle proteins are important sources. The higher plasma concentration of NAGs was in relation with an upregulated hexosamine biosynthesis, a pathway emanating from glycolysis. The reduced concentrations of phosphatidylcholines, sphingomyelins and other lipids reflected the enhanced synthesis of plasma membranes for the fast growing cancer cells. These results confirmed current knowledge that the metabolic reprogramming in cancer goes much wider than described by the Warburg effect. To date, the pathological stage at diagnosis remains the strongest prognostic factor in NSCLC. However, the current TNM staging system does not provide a satisfactory explanation of relapse and survival within a subgroup: each stage represents a heterogeneous population that consists of individuals with a high and a low risk of relapse and death. The inclusion of clinical and molecular biomarkers in the TNM system is a major challenge. To optimize treatment protocols for lung cancer further stratification in high- and low-risk patients is needed. First we evaluated the role of imaging parameters derived from PET-CT. We retrospectively reviewed 105 patients who underwent scanning with a PET-CT as part of the diagnostic work up. We used a semi-automatic delineation tool to measure the uptake of labeled glucose (18F-FDG). The maximum standardized uptake value (SUVmax), MATV and TLG of the primary tumor and the whole tumor burden were measured by using a threshold of 50% of the SUVmax value. Of all studied parameters, only the whole-body TLG (TLGWTB) was of prognostic value. Stratification of patients by TLGWTB might further complement prediction of outcome but the TNM stage remained the most important determinant of prognosis. Next, we aimed to develop a metabolic signature that was closely related with OS independent of stage. We performed 1H-NMR spectroscopy on plasma samples of 149 NSCLC patients corresponding with 99 I-IIIA and 50 IIIB-IV stage patients. First, we calculated a patient-specific risk score by means of a linear combination of the relative concentration of one or more IRs multiplied by a weighting value which was estimated from a multivariate Cox regression model (Cox I). To reduce the metabolic dataset (IRs), we applied the LASSO method. Next, the median risk score was used to classify patients into risk groups within stage I-IIIA and IIIB-IV. Substratification within these groups was not possible given the rather small patient population. Subsequently, the risk score was used as a covariate in a second Cox (Cox II) regression model that also took significant clinical–pathological characteristics into account. The signature for the risk score was validated using 1000 3-fold cross validation runs. At each step in the loop, a signature of IRs was used to calculate the risk score and to subdivide the patients into risk groups. The hazard ratios (HRs) between the low- and high-risk patients were calculated in the test set and training set, compared to each other and visualized in a boxplot. We developed metabolic signatures that differed significantly between NSCLC patients with good and poor OS. Patients in the high-risk group had a significant shorter median OS than patients in the low-risk group. Regarding stage I-IIIA, higher plasma levels of glutamine and histidine, and lower levels of creatinine and serine are characteristics of patients in the low-risk group and were associated with a favorable prognosis. A different prognostic signature was identified for more advanced NSCLC. Here, high concentrations of creatinine, triglycerides, histidine and proline resulted in stratification of the patient into the low-risk group. Further validation of these promising results in a large-scale prospective study is of course needed before clinical application.

Longkanker is de belangrijkste doodsoorzaak bij mannen en de tweede belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen wereldwijd. Naar schatting werden er in 2018 1,8 miljoen nieuwe longkankergevallen gediagnosticeerd en zouden 1,6 miljoen patiënten aan longkanker overlijden, hetgeen overeenkomt met 18,4% van alle kankerdoden. Het metabolisme omvat alle chemische processen waardoor gezonde cellen hun energie en redoxbalans stabiel kunnen houden en levert de bouwstenen die nodig zijn voor de celgroei, celdeling en overleving. Het aangepaste metabolisme van kankercellen werd goed gedocumenteerd en werd erkend als een van de tien kenmerken van kanker. Ondanks de histologische verschillen en genetische heterogeniteit van tumoren bestaan er een aantal gemeenschappelijke kenmerken. Eén van deze kenmerken is het Warburg effect: de productie van lactaat door afbraak van glucose (glycolyse) in de aanwezigheid van zuurstof. De tussenproducten van de glycolyse kunnen gebruikt worden voor de synthese van lipiden, nucleïnezuren en eiwitten waarmee de metabole behoeften van prolifererende cellen vervuld worden. In tegenstelling tot de initiële hypothese van Warburg, blijft het mitochondriaal metabolisme van cruciaal belang voor de groei van tumoren. De verhoogde opname en afbraak van glutamine in de mitochondria zorgen voor voldoende hoge concentraties van het natuurlijk antioxidant glutathion en voor het aanvullen van tussenproducten die verbruikt worden door de citroenzuurcyclus (Krebscyclus) in biosynthetische reacties. De metabole aanpassingen van longkankercellen werden besproken in hoofdstuk 2 van deze thesis. Op basis van het metabool profiel van plasma van longkankerpatiënten uit de NCT02024113 van Louis en collegae werd de mogelijkheid geëvalueerd om aan de hand van metabole afwijkingen een onderscheid te kunnen maken tussen longkanker en longontsteking. Dit is belangrijk omdat beeldvorming van de thorax, al dan niet in het kader van screening, vaak verdachte afwijkingen aantoont die resulteren in overbodige invasieve diagnostische procedures. Met behulp van 1H-NMRspectroscopie werd het metabool profiel van plasma bepaald in 347 controles, 269 kankerpatiënten en 108 patiënten met ontsteking. Aan de hand van PLS-LDA werd nagegaan of 1H-NMR metabolomics kan gebruikt worden om een verschil aan te tonen tussen de verschillende aandoeningen. De LASSO-methode werd toegepast om de meest differentiërende variabelen te selecteren (top K). Onafhankelijke validatie gebeurde aan de hand van een test set. Deze studie toonde aan dat een classificatiemodel bestaande uit de 16 meest differentiërende variabelen resulteerde in een gemiddelde MCE van 12% (maat voor het aantal verkeerde classificaties), een sensitiviteit van 89% en een specificiteit van 87%. Omdat de variabele IR89 (geïdentificeerd als glutamaat) werd geselecteerd in alle LASSO-lussen, werd het belang ervan verder onderzocht door de variabele te verwijderen uit de gegevens. Dit resulteerde in een toename van de MCE tot 38% en een belangrijke daling in sensitiviteit en specificiteit tot amper 62%. Deze grote toename in MCE toonde aan dat glutamaat belangrijk is in het classificatieproces. Om de diagnostische rol van de relatieve glutamaat concentratie verder te onderzoeken werd een receiver operating characteristic (ROC) curve geconstrueerd. Het optimale afkappunt (hier: een relatieve glutamaat concentratie van 0,31) voor de diagnose van kanker kwam overeen met een sensitiviteit van 85%, een specificiteit van 81% en een AUC van 0.88. De positieve predictieve waarde (PPV) en de negatieve predictieve waarde (NPV) waren respectievelijk 92% en 69%. De diagnostische waarde van PET-CT bij afwijkende radiologische bevindingen werd eveneens onderzocht. De sensitiviteit, specificiteit, PPV en NPV van PET-CT voor de diagnose van longkanker waren respectievelijk 96%, 23%, 76% en 71%. Door de lagere sensitiviteit (d.w.z. meer vals-negatieve resultaten) was glutamaat als enige diagnostische marker onvoldoende in staat om longkanker uit te sluiten. Om deze beperking te overwinnen, stelden we voor om de relatieve plasma-glutamaat concentratie te interpreteren in combinatie met PET-CT. Bij patiënten met zowel PET-positieve longafwijkingen en een lage relatieve glutamaat concentratie (suggestief voor kanker) zal een weefselbiopsie aanbevolen worden om de histologie te verkrijgen en om verdere therapie te begeleiden. In het geval van een negatieve PET-CT en een hoge relatieve glutamaat concentratie was follow-up met CT zonder het verrichten van diagnostische invasieve procedures gerechtvaardigd. Voorzichtigheid was geboden bij patiënten met tegenstrijdige resultaten, d.w.z. PET-positieve patiënten met een hoge relatieve glutamaat concentratie of PET-negatieve patiënten met een lage relatieve glutamaat concentratie. Bij deze patiënten werd een weefselbiopsie of een meer intensieve follow-up aanbevolen om de aanwezigheid van longkanker uit te sluiten of te bevestigen, aangezien 19% van de longkankers in deze groep niet werd gedetecteerd. Zoals beschreven in onze review over het metabolisme van longkanker bestaat er geen universeel metabool profiel van longkanker. Daarom hebben we ons in het volgende hoofdstuk gericht op het onderzoeken van mogelijke relaties tussen de plasma concentraties van metabolieten en de glycolytische activiteit. Met behulp van 1H-NMR-spectroscopie werden de relatieve concentraties van metabolieten in 222 patiënten met longkanker bepaald. Metabole beeldvorming aan de hand van PET-CT werd gebruikt om de standaard uptake waarden (SUV), het totale metabole actieve tumor volume (MATVWTB) en de totale letsel glycolyse (TLGWTB) te berekenen. Op basis van de mediane waarde van de PET parameters werden de patiënten verdeeld in groepen met een lage en hoge waarde van de PET parameter. Een univariate en een multivariate OPLS-DA statistische analyse werd uitgevoerd om een onderscheid te kunnen maken tussen longkankerpatiënten met hoge en lage 18F-FDG-opname. Aan de hand van 1H-NMR metabolomics kon worden aangetoond dat er een associatie bestaat tussen een groter MATV en / of een hogere TLG enerzijds en een hogere glucose-plasmaconcentratie anderzijds. Dit kan wijzen op een verhoogde gluconeogenese bij deze groep van longkankerpatiënten. De hogere opname van 18F-FDG correspondeerde ook met hogere concentraties van glucose precursors zoals glycerol en neoglucogene aminozuren (threonine, aspartaat en valine) die afkomstig zijn uit de afbraak van vetweefsel en spiereiwitten. De hogere plasmaconcentratie van N-acetyl glycoproteïnen (NAG's) kon worden toegeschreven aan een verhoogde activiteit van de hexosamine biosynthese pathway, een aftakking van glycolyse. De lagere concentraties van fosfatidylcholines, sfingomyelinen en andere lipiden weerspiegelden de toegenomen synthese van plasmamembranen in snelgroeiende kankercellen. Deze resultaten bevestigen de huidige kennis dat de metabole reprogrammatie bij kanker complexer is dan het Warburg-effect. Tot op heden is de TNM classificatie de belangrijkste factor om de prognose van niet-kleincellige longkanker te voorspellen. Een groot nadeel van het TNM stadiëringsysteem is dat de classificatie geen verklaring geeft voor de verschillen in overleving binnen een subklasse. Elk stadium vertegenwoordigt een heterogene populatie die bestaat uit patiënten met een hoog en laag risico op recidief en / of overlijden. Stratificatie binnen de TNM classificatie met behulp van klinische en moleculaire kenmerken is een grote uitdaging. Het opdelen van patiënten in risicogroepen binnen een specifiek stadium is belangrijk voor het optimaliseren van behandelingsprotocollen. In een eerste onderzoek hebben we de prognostische rol van PET-CT variabelen bestudeerd. De dossiers van 105 patiënten met longkanker, die in het kader van diagnostiek / stadiering een PET-CT hebben ondergaan, werden retrospectief geanalyseerd. Om de opname van gelabeld glucose (18F-FDG) te kwantificeren maakten we gebruik van een semiautomatisch afbakeningsinstrument. Zowel de SUVmax, het MATV en de TLG van de primaire tumor als de totale tumorload werden gemeten. Hiervoor werd voor elk letsel afzonderlijk een drempelwaarde van 50% van de SUVmax in acht genomen. Uit de resultaten bleek duidelijk dat de TLG van het hele lichaam (TLGWTB) een onafhankelijke voorspeller van de prognose was doch het stadium van de ziekte bleef de belangrijkste determinant van de prognose. In een tweede studie probeerden we een metabole handtekening te ontwikkelen die onafhankelijk van het stadium de prognose kon voorspellen. Hiervoor werd een 1H-NMR-spectroscopie uitgevoerd op plasma van 149 NSCLC-patiënten (99 patiënten met I-IIIA en 50 patiënten met IIIB-IV). Patiënt-specifieke risicoscores werden berekend aan de hand van een formule waarbij de relatieve concentraties van de metabolieten vermenigvuldigd werden met een coëfficiënt die bekomen werd uit een multivariaat Cox regressie model (Cox I). De LASSO-methode werd toegepast om de meest differentiërende variabelen te selecteren. Patiënten werden opgedeeld in risicogroepen aan de hand van de mediane risicoscore. Deze werkwijze werd gevolgd voor de stadium I-IIIA groep enerzijds en de stadium IIIB-IV groep anderzijds. Verdere opdeling volgens stadia was niet mogelijk wegens de relatief kleine patiëntenpopulatie. Significante klinische en pathologische kenmerken werden samen met de risicogroep gebruikt als covariabelen in een tweede Cox regressie model (COX II). De metabole handtekening die gebruikt werd om de risicoscore te berekenen, werd gevalideerd aan de hand van 1000 drievoudige kruisvalidaties. Op deze manier waren we in staat om een metabole handtekening met prognostische kenmerken samen te stellen voor zowel patiënten met stadia I-IIIA als met stadia IIIB-IV. In stadia I-IIIA zijn hogere plasmaspiegels van glutamine en histidine en lagere spiegels van creatinine en serine geassocieerd met een gunstige prognose. In de patiëntengroep IIIB-IV werd een andere prognostische handtekening geïdentificeerd. Hier resulteerden hoge concentraties van creatinine, triglyceriden, histidine en proline in de toewijzing van de patiënt aan de laag risicogroep. Deze veelbelovende resultaten moeten echter gevalideerd worden in een grootschalige prospectieve studie waarbij de stadia verder kunnen opgesplitst worden.