Schmidtea mediterranea's coping strategy against carcinogens: joint forces of stem cell’s intra- and extracellular cues

Abstract

Endorsed with the limitless capacity to self-renew, stem cells are able to shape (development), replenish (homeostasis) and restore (regeneration) an entire organism in response to specific (micro)environmental signals. This potential comes with a price, as an uncontrolled execution of these processes can lead to malignant growth. Stem cells are therefore equipped with an elaborate set of defence mechanisms to decrease the risk of adverse outcomes in high proliferative environments. While stem cells are highly active in a developmental or regenerative tissue, the tumour incidence is low in those contexts. Fundamentally understanding how regenerative processes can restrain carcinogenesis is two-fold. On the one hand, we need to understand how the stem cells respond to stress. On the other hand, we need to address the regenerationpromoting niche as stem cells responses depend on external cues, which, in some contexts, sprout malignancies while in others they induce a healing response. The highly regenerative planarian Schmidtea mediterranea has a strong coping capacity against several types of stressors, including carcinogens. While previous research linked this resilience with the (healing capacities) of their large pool of pluripotent stem cells, we are only beginning to understand the underlying mechanisms of these regenerative responses. Within the scope of this PhD, I aimed to contribute to the understanding of the regulatory mechanisms that underlie the high plasticity of S. mediterranea in response to carcinogens. On the one hand, I focused on stem cell–related stress responses, on the other hand, I aimed to determine if and how these defence mechanisms are under direct control of external cues. In the first part, the genotoxic compound methyl methanesulfonate (MMS) was used to investigate the planarian response to direct DNA damage. Comparing components of the DNA damage response pathway indicated that, following MMSinduced DNA damage, a different defence strategy was used depending on the physiological state of the animal, i.e. during homeostasis or regeneration. While homeostatic animals tended towards apoptotic responses, DNA repair was the preferred defence strategy in regenerating animals (Chapter 1). Apart from the physiological state of the animal, also intrinsic differences (i.e. stem cell subtype) seemed to influence the response to DNA damage as the gene expression pattern of a more lineage-restricted stem cell class was correlated with a pro-apoptotic marker. In chapter 2, I observed that the dynamics of the stem cell responses and ultimately the tissue outcome varied along the body-axis of the animal. More specifically, anterior body parts recovered better from previously-induced DNA damage. These regional differences could be explained by positional factors that vary along the body-axis. After interfering with the anteroposterior β-catenin gradient, regeneration could be re-activated in DNA-damaged fragments. In chapter 3, further examination of this rescue effect indicated that β-catenin exerts its stimulating effect via activating stem cell proliferation. Based on the increased expression of sigma subclass-related genes, we could hypothesize that β-catenin inhibition stimulated self-renewal. In the second part, the redox-disturbing heavy metal cadmium was used to determine defence responses to redox-mediated carcinogens. Here, I aimed to determine the role of previously identified mechanisms (related to Cd resilience) on stem cell dynamics and stem cell fate. Being the major cellular antioxidant, I aimed to investigate the importance of glutathione in the planarian antioxidant defence (Chapter 4). Our results confirmed that (the high level of) glutathione is a determining factor in response to stressors such as cadmium, but also during normal physiological processes. Surprisingly, we could not directly relate glutathione to be present in stem cells, indicating it could be either an extracellular signal or a defence mechanism in differentiated cells. In chapter 5, we further explored the role of a matrix-associated compound (MMPB). This enzyme was previously identified as a potential mechanism underlying the restorative responses to cadmium stress, as its knockdown induced the formation of epidermal outgrowths. In chapter 5, we characterized the nature of these outgrowths. Outgrowths contained actively-dividing stem cells, while the whole-body proliferation patterns were not affected. As such, we identified a direct effect of a matrix compound controlling stem cell processes that prevents proliferation outside the proper milieu. In summary, the data over the two parts combined indicate that stem cell restorative responses vary depending on the physiological status of the animal, the location along the body-axis and other niche-related signals. I described these stem cell stress responses and identified extracellular cues that influence these responses i.e. (yet to be determined) regeneration-associated cues, regional cues (via β-cat) in response to DNA damage and glutathione and MMPB in response to a redox-disturbing carcinogen.

Stamcellen liggen aan de basis van de ontwikkeling, het onderhouden en het herstellen van weefsels dankzij hun ongelimiteerde delings-en differentiatie capaciteiten. Deze mogelijkheden zijn echter niet zonder gevaar. Ongecontroleerd gedrag van deze cellen kan bijvoorbeeld leiden tot het ontwikkelen van kanker. Stamcellen zijn daarom voorzien van een uitgebreid netwerk aan verdedigingsmechanismen tegen allerlei vormen van (interne en externe) stress. Daarnaast speelt ook het omgevende weefsel een belangrijke rol in het controleren van stamcelprocessen. In een weefselcontext waar groei gestimuleerd wordt, zoals tijdens regeneratie (zijnde het herstellen van beschadigd of verloren weefsel), lijken stamcellen de juiste signalen te krijgen om enerzijds op volle kracht te werken, maar anderzijds ook te stoppen met delen wanneer nodig. Het is deze context die mee bepalend is in het sturen van stamcelprocessen richting herstel enerzijds of richting kanker anderzijds. De mate waarin een weefsel kan regenereren lijkt omgekeerd evenredig te zijn met de tumor incidentie. Daarom heeft het karakteriseren van de onderliggende mechanismen een belangrijke waarde in het beter begrijpen hoe stamcellen (dis)functioneren tijdens kankerprocessen. In functie van deze vraagstelling is het cruciaal om zowel stamcelresponsen als de sturende signalen uit het regenererende weefsel te bestuderen. De platworm Schmidtea mediterranea is hiervoor een ideaal model. Deze worm heeft een unieke regeneratiecapaciteit dankzij de grote aanwezigheid van adulte, pluripotente stamcellen die we makkelijk in vivo kunnen bestuderen. Uit voorgaand onderzoek is gebleken dat zijn regeneratief vermogen gepaard gaat met een uitzonderlijk veerkrachtige respons tegen kankerverwekkende stoffen. Directe blootstelling aan zulke stoffen leidt zelden tot nooit tot het vormen van tumoren. Dit organisme is daarom uitermate geschikt om te onderzoeken hoe pluripotente stamcellen in een regenererende context functioneren en daarmee kanker omzeilen. Mijn onderzoek focust zich op het karakteriseren hoe S. mediterranea zich verdedigt tegen carcinogene stress. Hierbij heb ik enerzijds in kaart gebracht hoe stamcellen reageren op carcinogene stress, anderzijds heb ik onderzocht welke (extra)cellulaire signalen stamcelprocessen beïnvloeden en zo bijdragen aan de uiterst efficiënte stress respons. In het eerste deel heb ik de genotoxische component methyl methaansulfonaat (MMS) gebruikt om DNA-schade te induceren en daaropvolgende stamcelresponsen (proliferatie, celdood, differentiatie en DNAherstelmechanismen) in kaart te brengen. Deze responsen bleken sterk afhankelijk van de fysiologische staat van het weefsel. Niet-regenererende weefsels investeerden minder sterk in herstel en DNA schade leidde hier voornamelijk tot celdood. Actief regenererende organismen zetten meer in op het herstellen van beschadigd weefsel, hetgeen bleek uit de verhoogde transcriptionele activiteit van DNA herstelmechanismen. De verdedigingsstrategie verschilde ook tussen verschillende stamceltypes. Stamcellen die beperkter zijn in het aantal celtypes waartoe ze aanleiding kunnen geven (‘zeta’ subklasse) kozen voor celdood, terwijl de stamcellen met een bredere capaciteit (‘sigma’ subklasse) meer geassocieerd waren met DNA herstel mechanismen. Wanneer DNA schade te ernstig was, was het organisme minder goed in staat om te herstellen en werd het regeneratieproces stilgelegd. Dit blokkerend effect kwam vooral tot uiting in posterior (staartjes) fragmenten, waar stamcel proliferatie sterker geïnhibeerd werd dan in anterior (kopjes) fragmenten. Dit leidde tot de hypothese dat β-catenine, een polarisatie-bepalende factor die volgens een gradiënt langsheen de lichaamsas actief is, mogelijks betrokken is in het sturen van stamcelprocessen onder stress. Het inhiberen van β-catenine bleek voldoende om proliferatie te stimuleren en zo regeneratie terug op te starten. Ook hier waren er verschillen binnen stamcelsubtypes en was het de meest potente subklasse die het sterkst gestimuleerd werd. In het tweede deel werd er gebruik gemaakt van cadmium, een zwaar metaal dat kankerverwekkend (type 1A) is door het verstoren van de redox balans. In dit deel was de doelstelling om eerder geïdentificeerde verdedigingsmechanismen te linken aan hun directe effecten op de stamceldynamiek. De resultaten bevestigden dat (de grote aanwezigheid van) glutathion, een belangrijk antioxidant, een cruciale rol speelt in het verweren tegen cadmium-geïnduceerde stress, en waarschijnlijk ook een belangrijke rol speelt in het regeneratieproces zelf. Een halvering van glutathion was onvoldoende om effecten uit te lokken in de stamceldynamiek, terwijl een volledige inhibitie lethaal was. Het was opvallend dat glutathion niet in de stamcellen zelf aanwezig bleek te zijn, wat maakt dat verder onderzoek zal moeten uitwijzen hoe het de stamceldynamiek kan beïnvloeden. Ook Matrix Metalloproteinase B (MMPB) werd eerder opgepikt in een proteoom screening als een mogelijke regulator van cadmium-geïnduceerde herstelmechanismen. Het uitschakelen van MMPB leidde tot de vorming van tumor-achtige malformaties. Hier hebben we de aard van deze laesies verder onderzocht en ontdekt dat deze structuren actief-delende stamcellen bevatten. We identificeerde hiermee een direct effect van een matrix-geassocieerde factor op stamcelprocessen, verantwoordelijk voor het inperken van proliferatie op foute plaatsen. De resultaten van beide delen leiden tot de algemene conclusie dat de grote weerbaarheid van S. mediterranea tegen kankerverwekkende stoffen te wijten is aan de samenwerking tussen stamcelresponsen enerzijds en een regulerende rol van het omliggend weefsel anderzijds. Stamcelresponsen variëren in functie van het stamcelsubtype (intrinsiek), maar ook in functie van extrinsieke signalen, met name de fysiologische toestand van het dier (intact versus regenererend) en de positie in het weefsel (anterior of posterior). Uit deze studie blijkt dat het dus belangrijk is om niet alleen stamcellen te bestuderen, maar zeker ook de invloed van het volledige weefsel. Schmidtea mediterranea is hiervoor een ideaal model en zijn bijzondere capaciteiten verder bestuderen kan ons helpen om kankerprocessen beter te begrijpen.