The Potential of Dental Pulp Stromal Cells and Their Derivatives for Angiogenesis and Cancer Therapy

Abstract

Stem cells have extensively been studied during the last decades as potential therapeutics in diverse disease models, including tissue regeneration and cancer. The most popular stem cell type is the mesenchymal stromal cell (MSC), which can be isolated from various foetal and adult tissues and is characterized by differentiation towards multiple functional mature cell types, including adipocytes, chondrocytes and osteocytes. Although most researchers use MSCs derived from the bone marrow (BM-MSCs), their clinical potential is compromised by their invasive and painful isolation. In contrast, dental pulp stromal cells (DPSCs) can easily be isolated from the central tooth pulp and express better proliferation and immunomodulatory capacities. Nevertheless, information on the therapeutic potential of this MSC subtype in tissue engineering and cancer is scarce, which was the topic of this dissertation. Tissue regeneration requires the fast blood supply of newly formed tissues by the process of angiogenesis. This multistep neovascularization process consists of extracellular matrix degradation, endothelial cell proliferation, migration and tube formation, vessel maturation and stabilization. Proangiogenic properties have previously been assigned to both BM-MSCs and DPSCs. Despite their broad differentiation potential, these effects are mainly mediated by paracrine secreted factors. This secretome, collected as conditioned medium (CM), consists of both soluble factors and nanoscale membrane-bound extracellular vesicles (EVs). In contrast to the short half-life associated with free molecules, EV-encapsulated proteins and miRNAs are better protected against enzymatic digestion, which could improve their therapeutic efficacy in the human body. Recent studies indicate the essential role of these EV-associated factors in the proangiogenic capacity of BM-MSCs. Therefore, this dissertation studied the potential of DPSC EVs as beneficial alternative for whole stem cell therapy to induce angiogenesis and eventual tissue regeneration. The relative contribution of soluble factors versus EVs to the paracrine angiogenic properties of DPSCs was studied and compared with those of BM-MSCs (Chapter II). Numerous pro- and antiangiogenic factors were detected in complete CM, EV-depleted CM and EVs. All these fractions significantly induced in vitro endothelial cell migration. Nevertheless, the protein concentrations and functional effects were stronger for CM compared to EVs, while no influence of EV depletion of the CM was observed. In addition, the chemotactic response and particle secretion were higher in case of BM-MSCs compared to DPSCs. Furthermore, the effect of BM-MSC and DPSC CM and EVs was validated in vivo in the chicken chorioallantoic membrane (CAM) assay. This in vivo angiogenic model using the strongly vascularized and fast developing extraembryonic membrane of the chicken embryo has proven its added value in the tissue engineering field as a fast, cheap and straightforward pre-screening tool for the angiogenic properties of growth factors, (stem) cells and scaffolds (Chapter III). BM-MSC CM, but not DPSC CM nor EVs, induced blood vessel formation in the CAM assay. Our study suggested superior paracrine angiogenic properties and eventual tissue regenerative capacity for BM-MSCs. Moreover, the complete secretome seems preferable in clinical regenerative medicine given the limited angiogenic effects of EVs and the high workload required to isolate and characterize pure EVs. Besides their therapeutic potential for tissue regeneration, MSCs could offer promising opportunities in the cancer research field due to their specific tumour homing capacity. Cancer is globally the second leading cause of death, after cardiovascular diseases, caused by the limited specificity and efficacy of current therapies. The tumour tropism of MSCs might be exploited to specifically deliver anti-cancer therapeutics to the tumour, resulting in lower effective doses and less adverse systemic side-effects. This dissertation investigated the relatively unexplored tumour homing of DPSCs and their effect on tumour growth and angiogenesis, since the influence of other MSC subtypes on tumour aggressiveness has described to be controversial (Chapter IV). Our study showed the in vitro tumour-dependent homing of DPSCs towards human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) and mouse melanoma cell lines, with no migration towards a human breast adenocarcinoma cell line. This tumour tropism could not be confirmed in an in vivo HNSCC xenograft mouse model after intravenous, intraperitoneal or peritumoural DPSC injection. Nevertheless, intratumourally administered stem cells survived for at least two weeks in the tumour microenvironment with no adverse effects on tumour growth, morphology and angiogenesis. While further studies should focus on the optimization of the experimental set-up to improve in vivo stem cell tumour homing, our data offer a first promising indication for the safe use of direct intratumourally injected DPSCs as potential delivery modes of anti-cancer therapeutics to treat HNSCC. In conclusion, this dissertation showed the therapeutic opportunities that DPSCs and their derivatives could offer in the tissue engineering and cancer research field. Further long-term in vivo studies should focus on the optimization of the experimental set-up to maximize the efficiency and safety of DPSC-based therapies.

Stamcellen zijn de afgelopen decennia uitvoerig bestudeerd als potentiële therapie in diverse ziektebeelden, waaronder weefselregeneratie en kanker. Het populairste stamceltype is de mesenchymale stromale cel (MSC), die geïsoleerd kan worden uit diverse foetale en adulte weefsels en gekenmerkt wordt door zijn differentiatie naar meerdere mature functionele celtypes, zoals vetcellen, kraakbeencellen en botcellen. Hoewel de meeste wetenschappers onderzoek doen naar MSCs uit het beenmerg (BM-MSCs), is het klinisch potentieel van deze stamcellen beperkt door hun invasieve en pijnlijke isolatie. Dentale pulpa stromale cellen (DPSCs) kunnen daarentegen eenvoudig geïsoleerd worden uit de centrale tandpulpa en vertonen betere proliferatie en immuunmodulerende eigenschappen. Desondanks is er nog weinig gekend over de therapeutische mogelijkheden van dit MSC subtype in weefselregeneratie en kanker, wat het onderwerp vormde van dit proefschrift. Weefselregeneratie vereist een snelle vorming van bloedvaten, ook wel angiogenese genoemd, die nodig is voor de toevoer van zuurstof naar de nieuwgevormde weefsels. Angiogenese bestaat uit meerdere stappen, namelijk afbraak van de omliggende extracellulaire matrix, vervolgens proliferatie, migratie en tubevorming van endotheelcellen en tenslotte stabilisatie van de bloedvaten na rekrutering van pericyten. Pro-angiogene eigenschappen zijn reeds eerder aangetoond voor zowel BM-MSCs als DPSCs. Beide celtypes kunnen de bloedvatvorming induceren door paracrien gesecreteerde factoren. Dit secretoom, gecollecteerd als geconditioneerd medium (CM), bevat zowel opgeloste factoren als ultrakleine membraangebonden extracellulaire vesikels (EVs). In tegenstelling tot de korte halfwaardetijd geassocieerd met vrije moleculen, zijn de eiwitten en miRNAs ingekapseld in EVs beter beschermd tegen enzymatische digestie, wat hun therapeutische werking in het menselijk lichaam kan verhogen. Recente studies wijzen op een essentiële rol van deze EV-geassocieerde factoren in de proangiogene capaciteit van BM-MSCs. Het doel van dit proefschrift was daarom om te onderzoeken of DPSC EVs een gunstig alternatief kunnen bieden voor de klassieke MSC therapie in angiogenese. De relatieve bijdrage van opgeloste factoren versus EVs in de paracriene angiogene eigenschappen van DPSCs werd bepaald en vergeleken met deze van BM-MSCs (Hoofdstuk II). Vele pro- en antiangiogene factoren waren aanwezig in volledig CM, EV-arm CM en EVs. Hoewel in vitro endotheelcelmigratie geïnduceerd werd door alle fracties, lagen de eiwitconcentraties hoger en waren de functionele effecten sterker bij het CM ten opzichte van de EVs. Bovendien had EV depletie geen invloed op het angiogeen profiel van het CM. Daarnaast was er ook een significant verschil tussen beide stamceltypes met meer endotheelcelmigratie en partikelsecretie voor BM-MSCs. De bloedvatvorming werd ook bestudeerd in het kip chorioallantoic membraan (CAM) assay. Dit sterk gevasculariseerde en snel ontwikkelende extra-embryonaal membraan van het kippenembryo heeft zijn meerwaarde als snelle, goedkope en eenvoudige in vivo pre-screening methode voor de angiogene eigenschappen van groeifactoren, (stam)cellen en scaffolds reeds uitvoerig bewezen (Hoofdstuk III). BM-MSC CM, maar niet DPSCs of EVs, kon bloedvatvorming induceren in de CAM assay. Deze data suggereren superieure paracriene angiogene en regeneratieve eigenschappen voor BM-MSCs. Bovendien is gebruik van het volledige secretoom aangeraden in klinische regeneratieve geneeskunde omwille van de beperkte angiogene effecten van EVs en de hoge werkdruk en kosten die gepaard gaan met de isolatie en karakterisatie van zuivere EVs. Naast hun therapeutisch potentieel in weefselregeneratie kunnen MSCs ook interessante mogelijkheden bieden in kankeronderzoek dankzij hun eigenschap om specifiek naar tumoren te migreren (ook tumortropisme genoemd). Omwille van de beperkte specificiteit en efficiëntie van de huidige therapieën blijft kanker wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak, na cardiovasculaire ziektes. Het tumortropisme van MSCs kan benut worden voor het specifiek aanleveren van anti-kankertherapie in de tumor met lagere effectieve dosissen en minder systemische neveneffecten tot gevolg. Deze doctoraatsthesis onderzocht het ongekende tumortropisme van DPSCs en hun invloed op tumorgroei en angiogenese, aangezien controversiële effecten op tumor agressiviteit eerder zijn aangetoond voor andere MSC subtypes (Hoofdstuk IV). In vitro migreerden DPSCs enkel naar humane hoofd en nek plaveiselcelcarcinoom (HNSCC) en muis melanoom cellijnen en niet naar een humane borstadenocarcinoom cellijn. Deze migratie kon niet bevestigd worden in een in vivo HNSCC xenograft muismodel na intraveneuze, intraperitoneale of peritumorale stamcelinjectie. Intratumoraal toegediende DPSCs overleefden gedurende minstens twee weken in het tumor micromilieu zonder nadelige effecten op tumorgroei, morfologie en angiogenese. Hoewel de experimentele set-up verder geoptimaliseerd moet worden in toekomstige studies om in vivo stamcelmigratie naar tumoren te verbeteren, bieden onze data een eerste veelbelovende indicatie voor het veilig gebruik van intratumoraal geïnjecteerde DPSCs als aanhoudende bron van anti-kanker medicatie voor de behandeling van HNSCC. Ter conclusie, dit proefschrift toont aan dat DPSCs en hun derivaten vele therapeutische mogelijkheden kunnen bieden voor weefselregeneratie en kanker. Bijkomend onderzoek in langtermijn preklinische studies is essentieel om de efficiëntie en veiligheid van DPSC-gebaseerde therapieën verder te optimaliseren.