Dental Stem Cells and Leukocyte- and Platelet-Rich Fibrin as Candidate Therapies for Joint Repair

Abstract

Musculoskeletal disorders (MSDs) include more than 150 diverse pathologies since they can affect but are not limited to muscles, bones, joints, cartilage, ligaments, and tendons. According to the World Health Organization (WHO), MSDs are the main cause for severe long-term pain and physical disability, and affect hundreds of millions of people around the world. Degeneration of the joint leads to injury to tissues from the joint, including articular cartilage and tendons. Cartilage injuries are very common, and form a risk factor for the development of osteoarthritis (OA), which is a degenerative and inflammatory condition of synovial joints with irreversible loss of supportive cartilage matrix. In addition to OA, over 30 million tendon-related surgeries take place per year worldwide with a significant socioeconomic burden. Moreover, tendon lesions represent 30% of all musculoskeletal consultations. Unfortunately, both OA and tendinopathy involve tissues that are characterized by a low intrinsic healing capacity and current treatment options are not able to provide full and stable recovery of the damaged tissue. Therefore, there is a growing need for the development of new treatment options for OA, cartilage defects and tendon injuries. Autologous chondrocyte implantation or the transplantation of tendon-derived stem cells have been proposed as efficient cellbased therapies for treating chondral lesions or OA and tendon injuries respectively. However, the usage of adult autologous tissue-specific cells requires a two-step surgery and is associated with several other drawbacks. Therefore, innovative tissue engineering techniques exploiting compatible scaffolds and stem cells are currently needed. Stem cell-based therapies are seen as one of the most promising treatment strategies within regenerative research, since they have been widely used as therapeutic applications for many untreatable injuries and diseases. For stem cell-based strategies for OA or tendinopathies, mesenchymal stem cells (MSCs) are of particular interest. Most studies using a MSC-based cell therapy focus on bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs). However, this type of MSC is associated with several downsides. First, the isolation of BM-MSCs is invasive and is associated with several complications. Secondly, BM-MSCs often result in hypertrophic differentiation. A promising alternative stem cell niche can be found in tooth-associated tissues, such as the dental pulp or the periodontal ligament tissue. Dental pulp stem cells (DPSCs) are isolated from the dental pulp and were first isolated by Gronthos et al. Since their first isolation, several others revealed their MSC-like characteristics, including their immunophenotyping, plastic adherence and the ability to differentiate into classical mesodermal cell lineages; adipocytes, osteocytes and chondrocytes in vitro. In contrast to BM-MSCs, DPSCs showed a higher proliferative rate and have an easy isolation procedure by which they can be obtained. Additionally, the immunomodulatory properties of DPSCs emphasize their promise as cell-based therapies for immune-related diseases. Periodontal ligament stem cells (PDLSCs) are isolated from the periodontal ligament tissue and have been described to be a promising cell source for tendonregenerative applications because of their inherent ligamentous nature and their native expression pattern of tendon-associated markers. In addition to MSCs, platelet concentrates are emerging as promising treatment possibilities because of their high amount in growth factors and cytokines, which have been described to play crucial roles in wound healing and immunomodulation. However, since the well-studied platelet derivative; platelet rich plasma (PRP), requires the supplementation of anti-coagulants and biochemical handling before preparation, the use of leukocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF), a second generation platelet concentrate, is encouraged. In Chapter 2 of the current dissertation, we evaluated the therapeutic application of DPSCs and L-PRF in OA via immunomodulation and cartilage regeneration. Strong paracrine-mediated effects of DPSCs in an in vitro OA model were shown, as they undergo chondrogenesis in vitro, stimulate the survival of chondrocytes and have immunomodulatory effects. In contrast, L-PRF did not show promising secretome-mediated effects on OA chondrocytes and was unable to enhance chondrogenesis of DPSCs and BM-MSCs in vitro. In Chapter 3, we studied the ability of a three-dimensional (3D) growth condition under static tension and the supplementation of transforming growth factor-beta 3 (TGF-β3) to generate in vitro tendon-like tissues of DPSCs and PDLSCs and compared them to BM-MSCs. In this chapter, we validated the feasibility of the usage of PDLSCs as a novel cell source for tendon repair. Cell alignment, cell density and gel contraction seemed to be improved in PDLSC-seeded constructs. All three stem cell types showed positive expression of tendon-related markers, tenascin C and tenomodulin. In contrast to BM-MSCs and DPSCs, PDLSC-derived constructs displayed the presence of collagen fibrils and less bone and cartilage components. Taken together, our study validated the usage of PDLSCs as a novel cell source for tendon repair Before novel cell-based therapies for cartilage repair can be introduced into the clinic, rigorous testing in preclinical animal models is required. Preclinical models used in regenerative cartilage studies include murine, lapine, caprine, ovine, porcine, canine, and equine models, each associated with their specific advantages and limitations. Chapter 4 represents an overview of the advantages and disadvantages of utilizing small and large animals and different outcome measures to assess cartilage repair. Researchers should be aware that every animal model is associated with its drawbacks and the choice of model strongly depends on the research hypothesis to ensure the translation to the clinic. Furthermore, the current lack of standardized protocols as well as the wide variety of outcome measures used to evaluate preclinical studies make it difficult to draw definite conclusions regarding the potential use of stem cell-based approaches in cartilage tissue engineering through direct comparison of studies. Finally, for preclinical animal studies, the usage of autologous MSCs is the ideal approach to avoid rejection. In Chapter 5, we demonstrated that ovine DPSCs were effectively isolated from dental pulp tissue and showed morphological, phenotypical and functional properties similar to those observed in their human counterparts. We showed that ovine DPSCs may have potential use in osteochondral engineering. Moreover, because of promising paracrine-mediated effects by human DPSCs on OA-mimicked chondrocytes in vitro, preclinical OA studies in the ovine model using ovine DPSCs are encouraged. Nonetheless, the work in this thesis paves the way for preclinical studies that focus on DPSC-based stem cell therapies for OA. Future studies should aim to test their (autologous) efficacy in a large animal model of OA and focus on longitudinal follow-up with non-invasive imaging methods. Moreover, PDLSCs have been proposed to be a promising alternative source, when compared to DPSCs or BMMSCs, for cell-based regenerative treatment for tendon repair. However, future studies should aim to test their effectiveness in larger translation models.

Musculoskeletale aandoeningen omvatten meer dan 150 verschillende pathologieën aangezien ze spieren, botten, gewrichten, kraakbeen, ligamenten en pezen kunnen aantasten. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie zijn musculoskeletale aandoeningen de hoofdoorzaak van langdurige pijn en lichamelijke beperkingen en treffen honderden miljoenen mensen over de hele wereld. Degeneratie van het gewricht kan leiden tot letsels aan weefsels van het gewricht, waaronder gewrichtskraakbeen en pezen. Kraakbeenletsels komen erg vaak voor en vormen een groot risico voor de ontwikkeling van osteoartritis, een degeneratieve en inflammatoire aandoening van synoviale gewrichten met onomkeerbaar verlies van ondersteunende kraakbeenmatrix. Naast osteoartritis, vinden wereldwijd jaarlijks meer dan 30 miljoen pees-gerelateerde ingrepen plaats met een aanzienlijke sociaaleconomische last. Bovendien vertegenwoordigen peeslaesies 30% van alle musculoskeletale consultaties. Helaas hebben zowel osteoartritis als tendinopathieën betrekking tot weefsels die worden gekenmerkt door een laag intrinsiek regeneratie vermogen en de huidige behandelingsopties zijn niet in staat om volledig en stabiel herstel van het beschadigde weefsel te verzekeren. Daarom is er een sterke nood aan de ontwikkeling van nieuwe behandelingsopties voor osteoartritis, kraakbeendefecten en peesblessures. Autologe chondrocytenimplantatie of transplantatie van pees-stamcellen werden reeds voorgesteld als efficiënte celgebaseerde therapieën voor de behandeling van respectievelijk chondrale laesies of osteoartritis en peesletsels. Het gebruik van autologe weefselspecifieke cellen vereist echter een tweestaps operatie en gaat gepaard met verschillende andere nadelen. Daarom zijn momenteel innovatieve weefseltechnieken nodig die gebruik maken van compatibele scaffolds en stamcellen. Stamcel-gebaseerde therapieën worden gezien als een van de meest veelbelovende behandelingsstrategieën binnen regeneratief onderzoek, aangezien ze voor veel onbehandelbare pathologieën op grote schaal onderzocht en gebruikt worden. Voor stamcel-gebaseerde behandelingsstrategieën voor osteoartritis of tendinopathieën bieden mesenchymale stamcellen (MSCs) bijzondere voordelen. De meeste MSC-gebaseerde studies richten zich vooral op beenmerg MSCs (BMMSCs). Dit type MSC gaat echter gepaard met verschillende nadelen. Ten eerste is de isolatie van BM-MSCs erg invasief en kan gepaard gaan met verschillende complicaties. Ten tweede resulteren BM-MSCs vaak in hypertrofische differentiatie. Een veelbelovend alternatieve niche voor stamcellen zijn tandgeassocieerde weefsels, zoals de tandpulp of het parodontale ligamentweefsel. Dentale pulpa stamcellen (DPSCs) worden geïsoleerd uit de tandpulp en werden voor het eerst geïsoleerd door Gronthos et al. Sinds hun eerste isolatie onthulden verschillende anderen hun MSC-achtige kenmerken, waaronder hun immunofenotypering, vermogen om te hechten aan plastiek en het vermogen om te differentiëren naar klassieke mesodermale cellijnen; adipocyten, osteocyten en chondrocyten in vitro. In tegenstelling tot BM-MSCs, vertoonden DPSCs een hogere proliferatief vermogen en hebben ze een gemakkelijke isolatieprocedure waarmee ze kunnen worden verkregen. Bovendien benadrukken de immunomodulerende eigenschappen van DPSCs hun veelbelovend gebruik voor immuun-gerelateerde ziekten. Parodontale ligament stamcellen (PDLSCs) worden geïsoleerd uit het parodontale ligamentweefsel en werden reeds beschreven als een veelbelovende celbron voor peesregeneratieve toepassingen vanwege hun inherente ligamenteuze aard en hun natuurlijke expressiepatroon van peesgeassocieerde merkers. Naast MSCs worden plaatjesconcentraten meer en meer als veelbelovende behandelingsmogelijkheden voorgesteld vanwege hun hoge concentratie aan groeifactoren en cytokines, waarvan is beschreven dat ze cruciale rollen spelen bij wondgenezing en immunomodulatie. Echter, aangezien het bekende bloedplaatjesderivaat; bloedplaatjesrijk plasma (PRP), de toevoeging van anticoagulantia en biochemische behandeling vóór bereiding vereist, wordt het gebruik van leukocyten- en bloedplaatsjesrijk fibrine (L-PRF), een bloedplaatjesconcentraat van de tweede generatie, aangemoedigd. In Hoofdstuk 2 van het huidige doctoraatsproefschrift evalueerden we de therapeutische toepassing van DPSCs en L-PRF in osteoartritis via immunomodulatie en kraakbeenregeneratie. Sterke paracrien-gemedieerde effecten van DPSCs in een in vitro osteoartritis-model werden aangetoond, aangezien ze in vitro chondrogenese ondergaan, de overleving van chondrocyten stimuleren en immunomodulerende effecten hebben. Daarentegen vertoonde LPRF geen veelbelovende secretoom-gemedieerde effecten op osteoartritischondrocyten en was L-PRF niet in staat de chondrogenese van DPSCs en BMMSCs in vitro te versterken.In Hoofdstuk 3 bestudeerden we het vermogen van een driedimensionale celcultuur omgeving onder statische spanning en de toevoeging van transforming growth factor-beta 3 (TGF-β3) om in vitro peesachtige-constructen van DPSCs en PDLSCs te genereren en te vergelijken met BM-MSCs. In dit hoofdstuk hebben we het gebruik van PDLSCs als nieuwe celbron voor peesherstel gevalideerd. Celalignering, celdichtheid en gelcontractie waren sterker in PDLSC-afkomstige constructen. Alle drie stamceltypen vertoonden positieve expressie van peesgerelateerde merkers, tenascin C en tenomoduline. In tegenstelling tot BM-MSCs en DPSCs, vertoonden PDLSC-afkomstige constructen de aanwezigheid van collageenfibrillen en minder bot- en kraakbeencomponenten. Tot slot, heeft onze studie het gebruik van PDLSCs als een nieuwe celbron voor peesherstel gevalideerd. Vooraleer nieuwe cel-gebaseerde therapieën voor kraakbeenherstel in de kliniek kunnen worden geïntroduceerd, is rigoureus testen in preklinische diermodellen vereist. Preklinische modellen die worden gebruikt in regeneratieve kraakbeenstudies omvatten muizen, konijnen, geiten, schapen, varkens, honden en paarden, elk geassocieerd met hun specifieke voordelen en beperkingen. Hoofdstuk 4 geeft een overzicht van de voor- en nadelen van het gebruik van kleine en grote diermodellen en de verschillende evaluatiemethoden om kraakbeenherstel te bestuderen. Onderzoekers moeten zich ervan bewust zijn dat elk diermodel geassocieerd kan worden met nadelen en dat de keuze van het model sterk afhangt van de onderzoekshypothese om de translatie naar de kliniek te verzekeren. Bovendien maken het huidige gebrek aan gestandaardiseerde protocollen en de grote verscheidenheid aan evaluatiemethoden het moeilijk om definitieve conclusies te trekken over het mogelijke gebruik van stamcelgebaseerde behandelingsstrategieën voor kraakbeenweefsel door directe vergelijking van studies. Voor preklinische dierstudies zou het gebruik van autologe MSCs de ideale strategie zijn om afstoting te voorkomen. In Hoofdstuk 5 toonden we aan dat schaap DPSCs effectief geïsoleerd werden uit de dentale pulpa en morfologische, fenotypische en functionele eigenschappen vertoonden die gelijkaardig waren aan humane DPSCs. We toonden aan dat DPSCs van schapen mogelijk van belang zouden kunnen zijn voor osteochondrale engineering. Hierbij worden preklinische osteoartritis-studies in het schapenmodel met schaap DPSCs aangemoedigd vanwege de veelbelovende paracrien-gemedieerde effecten van DPSCs in een osteoartritis model in vitro. Desalniettemin effent het werk in dit doctoraatsproefschrift de weg naar preklinische studies die zich richten op DPSC-gebaseerde stamceltherapieën voor osteoartritis. Vervolgstudies dienen zich te richten op het testen van hun (autologe) werkzaamheid in een groot diermodel van osteoartritis en zich richten op een longitudinale follow-up met niet-invasieve beeldvormingsmethoden. Bovendien werden PDLSCs als een veelbelovende alternatieve bron voorgesteld voor cel-gebaseerde regeneratieve behandelingen voor peesherstel. Toekomstige studies moeten er echter op gericht zijn hun doeltreffendheid in grotere diermodellen te testen.