Conductive structures in cable bacteria: a study of the electrical and compositional properties of the periplasmic conductive structures in cable bacteria

Abstract

Cable bacteria are filamentous multicellular microorganisms discovered in Aarhus (Denmark) by the group of Prof. Lars Peter Nielsen of Aarhus University, that grow in the centimetre scale range and can contain more than 10,000 cells in a single filament. They are found in different environments and have been found to thrive in different parts of the world. Generally, cable bacteria filaments are found to grow just under the water-sediment interface. As part of their metabolism, scientists have found that cable bacteria grow to such lengths to oxidize sulphide deep within the sediment simultaneously with reducing dissolved oxygen at the water-sediment interface. In essence, the two spatially separated half-cell redox reactions occur due to the flow of electrons from sulphide oxidation to oxygen reduction through the filament. This sort of cooperation in bacteria is unprecedented. Previous works at X-LAB in partnership with the group of Prof. Filip Meysman of University of Antwerp/TU Delft have shown that the conductive structures in the bacterium are present in its periplasmic space. However, identification of the conductive pathways in the periplasmic space had remained elusive. The composition of the periplasmic space is fundamental in further understanding of the conductive structure and the possible conductive mechanisms. This thesis tries to answer two fundamental questions: (A) Where are the conductive pathways present? Do the pathways possess an interconnected network? (B) What is the periplasmic space made of? Can mass spectrometry provide more insight into the functioning of the cable bacteria? To answer the first question, we used conductive atomic force microscopy (CAFM) and developed an appropriate measurement protocol. We connected one end of the filament to a voltage source, and the probe, which is also conductive, acts as the second electrode completing the circuit. This setup was placed within a nitrogen glovebox. The probe removed the top surface of the layer, displaying the parallel electrically conductive areas where the periplasmic space is located. As the probe went digging deeper, no current was measured in the cytoplasm. This proved that the conductive structures are present only in the periplasm. In our earlier research, we found an unusual “cartwheel” structure that is present between two cells. Based on an innovative AFM based lithography approach, we discovered that the junction between two adjacent cells, possibly the “cartwheel” structure, provides electrical interconnectivity. This shows that cable bacteria have a fail-safe electrical network. When we extracted the periplasmic space from the filament, we found the resulting skeletal structure known as a fibre sheath to be conductive. Our C-AFM measurements confirmed the earlier two-probe measurements as we again imaged the conductive wires running parallel along the filament length. We also showed the ridges on the surface of the fibre sheath contain the conductive wires within them. We elaborate on these results in paper A (Appendix I), published in Advanced Biosystems. The fibre sheath is more or less the content of the periplasmic space, located between the outer and inner membrane of the cable bacterium. An analysis of its composition would shed more light on the conduction mechanism in cable bacteria as such. To understand what the fibre sheath is made of, we employed multiple characterization techniques as discussed in paper B (Appendix II), of which time of flight – secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) is one of the most important techniques employed. We employed TOF.SIMS5 equipment from IONTOF GmBH, Germany, equipped with an in-situ AFM located at imec. ToF-SIMS data followed by principal component analysis (PCA) of the various identified fragments revealed that the fibre sheath is made of protein fibres that are held together by a basal sheath made of polysaccharides. Each protein fibre consists of a Ni-S rich protein core that is suspected to be responsible for electron transport and a thin Ni deficient shell which acts as an insulative cladding. The role of Ni-S in the conduction mechanism is still not clear. This model agrees with our C-AFM results in paper A since the outer layer of fibre sheath was found to be non-conductive. Ni-based electron transport is not heard of as typically Fe and Cu based metalloproteins are responsible for electron transport. The basal sheath is possibly made of peptidoglycan, found in many gram-negative bacteria, although this needs to be verified. ToF-SIMS gives intensity (counts) profiles of various fragments generated as the sample gets sputtered. However, the depth profile is given in terms of sputter time, instead of distance. One way to translate sputter time into sputter distance is to use an AFM or a profilometer. The ToF-SIMS instrument at our disposal was already equipped with an in-situ AFM, where a topography measurement can be done before and after sputtering and the height images subtracted to calculate the sputter depth. Ni layer was found about 15 nm under the top layer, and the fibre sheath was found to be about 120 nm thick, which agrees with the AFM measurements reported by us earlier in another publication (Cornelissen et al., 2018). ToF-SIMS data, along with other characterization results from other partners, forms the crux of paper B. To get a good mass resolution, we employed a technique in paper B called high current bunching (HCB). However, this comes at a loss of lateral resolution. By using a technique called fast imaging delayed extraction (FI-DE), a lateral resolution of 400 nm can be obtained with a nominal loss of mass resolution. Total intensity images revealed that the body of the bacteria had a different composition compared to the junction. Analysis of body of cable bacteria revealed not only a subsurface Ni peak but also a less intense and broader second peak. This second peak is the contribution from the bottom part of the fibre sheath. This profile was not seen in paper B, possibly due to the uneven distribution of cytoplasmic content in different cells in a large area. Since we could select smaller areas for the FI-DE mode, these areas were pre-selected based on optical microscopy data. We compared the profiles of various fragments from the body to that of the junction. Interestingly, a Ni peak was seen, followed by a significant drop of Ni signal from both the body and the junction. If Ni is also present in the cartwheel, one could expect Ni signal to have a peak in intensity in the middle of the junction’s depth. AFM based lithography followed by C-AFM measurement, identical to paper A, revealed that there are no interconnects present in fibre sheath. Using the in-situ AFM, the depth at which Ni is present was determined. This work is part of paper C (Appendix III).

Kabelbacteriën zijn lange meercellige micro-organismen, ontdekt in Aarhus (Denemarken) door de groep van Prof. Lars Peter Nielsen van Aarhus Universiteit, die tot centimeters lang kunnen groeien door een filament van meer dan 10 000 cellen te vormen. Ze komen voor in verschillende habitats en op verschillende plaatsen ter wereld. Algemeen gezien groeien kabelbacteriën net onder de watersedimentscheiding van zoete en zoute wateren. Als deel van hun metabolisme vonden wetenschappers dat de bacteriën tot dergelijke lengtes groeien om gelijktijdig sulfide diep in het sediment te oxideren en opgeloste zuurstof aan de wateroppervlakte te reduceren. In essentie gebeuren de twee gescheiden halve redoxreacties dankzij een stroom van elektronen van de sulfideoxidatie naar de zuurstofreductie door het filament. Deze vorm van samenwerking in bacteriën is ongekend. Eerder werk aan XLAB in samenwerking met de groep van Prof. Filip Meysman van UAntwerpen/TUDelft heeft aangetoond dat de geleidende structuren van de bacterie aanwezig zijn in de periplasmische ruimte. De identificatie van de precieze geleidende paden van de bacterie bleef echter ongekend. De samenstelling van de periplasmische ruimte is fundamenteel voor een verder begrip van de geleidende structuur en de mogelijke geleidingsmechanismen. Deze thesis tracht een antwoord te geven op twee fundamentele vragen: (A) Waar zijn de geleidende paden? Bezitten ze een onderlinge verbindend netwerk? (B) Waaruit bestaat de periplasmische ruimte? Kan massa spectrometrie meer inzicht bieden in de werking van kabelbacteriën? Om de eerste vraag te beantwoorden gebruikten we geleidende atoomkrachtmicroscopie (conductive atomic force microscopy of C-AFM) en ontwikkelden we een geschikt meetprotocol. We verbonden één uiteinde van het filament met een spanningsbron en de geleidende AFM-sonde fungeerde als een tweede elektrode zodat het circuit gesloten was. Het geheel werd in een stikstofkamer geplaatst. De sonde verwijderde de toplaag van de bacterie, waardoor parallelle geleidende gebieden zichtbaar werden in de periplasmische ruimte. Wanneer de sonde dieper tot in het cytoplasma reikte, werd er geen stroom meer gemeten. Dit bewees dat de geleidende structuren enkel aanwezig zijn in het periplasma. In ons eerdere onderzoek vonden we een ongewone “karrenwiel”-structuur in de verbinding tussen twee cellen. Door gebruik te maken van een innovatieve AFM gebaseerde lithografietechniek, verbinding tussen twee aangrenzende cellen, mogelijk de "karrenwiel" -structuur. Dit bewijst dat kabelbacteriën een elektrisch netwerk met interne zekering bezitten. Wanneer we de periplasmische ruimte van het filament extraheerden, vonden we dat de resulterende skeletstructuur (de zogenaamde fibre sheath) ook geleidend is. Onze C-AFM metingen bevestigden de eerdere elektrische metingen met twee elektrodes en geven een beeld van de geleidende draden die parallel over de lengte van het filament lopen. Daarnaast toonden we ook dat de geleidende structuren precies overeenkomen met de ribbels aan de oppervlakte van de fibre sheath. We bespreken deze resultaten uitvoerig in Paper A (Appendix I), gepubliceerd in Advanced Biosystems. De fibre sheath is min of meer de inhoud van de periplasmische ruimte die zich bevindt tussen het buitenste en binnenste membraan van de kabelbacterie. Een analyse van zijn samenstelling zou meer duidelijkheid kunnen geven over het geleidingsmechanisme in kabelbacteriën. Om te begrijpen waar de fibre sheath van gemaakt is, gebruikten we verschillende karakterisatietechnieken zoals voorgesteld in paper B (Appendix II), van welke time of flight – secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) een van de meest belangrijke gebruikte technieken was. We gebruikten TOF.SIMS5 apparatuur van IONTOF GmBH, Duitsland, uitgerust met een in-situ AFM in imec. ToF-SIMS data, gevolgd door principal component analysis (PCA), van de verschillende geïdentificeerde fragmenten onthulden dat de fibre sheath opgebouwd is uit eiwitvezels of fibres die bij elkaar worden gehouden door een basis-sheath gemaakt van polysacchariden. Elke eiwitvezel bestaat uit een Ni-S rijke proteïnekern waarvan wordt verondersteld dat deze verantwoordelijk is voor het elektronentransport en een dun Ni-deficiënt omhulsel dat fungeert als een isolerende laag. De rol van Ni-S in het geleidingsmechanisme is tot hier toe onduidelijk. Het voorgestelde model komt overeen met onze C-AFM-resultaten in paper A, aangezien de buitenste laag van de fibre sheath niet-geleidend bleek te zijn. Op Ni gebaseerd elektronentransport is tot op heden ongekend; typisch zijn metalloproteïnen op basis van Fe en Cu verantwoordelijk zijn voor elektronentransport. De basisomhulling is mogelijk gemaakt van peptidoglycaan, dat in veel gram-negatieve bacteriën wordt aangetroffen, hoewel dit moet worden geverifieerd. ToF-SIMS geeft intensiteitsprofielen van de verschillende fragmenten die worden gegenereerd wanneer het sample wordt gesputterd. Het diepteprofiel wordt echter gegeven in functie van de sputtertijd, niet afstand. Een manier om de sputtertijd om te zetten in de sputterafstand is door gebruik te maken van een AFM of een profilometer. Het ToFSIMS-instrument dat we tot onze beschikking hadden, was reeds uitgerust met een insitu AFM, waardoor een topografische meting kan worden gedaan voor en na het sputteren en het verschil van de hoogtebeelden de sputterdiepte beschrijft. De Ni-laag werd ongeveer 15 nanometer onder de bovenste laag gevonden en de fibre sheath bleek ongeveer 120 nanometer dik te zijn, wat overeenkomt met de AFM-metingen uit een eerdere publicatie (Cornelissen et al., 2018). ToF-SIMS-gegevens vormen, samen met andere karakteriseringsresultaten van andere partners, de crux van paper B. Om een goede massaresolutie te krijgen, gebruikten we in paper B een techniek genaamd high current bunding (HCB). Dit gaat echter gepaard met verlies van laterale resolutie. Door een techniek genaamd fast imaging delayed extraction (FI-DE) te gebruiken, kan een laterale resolutie van 400 nanometer worden verkregen met een nominaal verlies aan massaresolutie. Metingen van de totale intensiteit lieten zien dat de cellen van de bacteriën een andere chemische samenstelling hadden dan de verbindingen tussen de cellen. Analyse van de cellen van kabelbacteriën onthulde niet alleen een Ni-piek onder de oppervlakte, maar ook een minder intense en bredere tweede piek, afkomstig van het onderste deel van de fibre sheath. Dit profiel werd niet waargenomen in paper B, mogelijks vanwege een ongelijke verdeling van het cytoplasma in de verschillende cellen over een grote regio van de bacterie. Aangezien we in FI-DE modus kleinere regio’s konden kiezen, hebben we enkele regio’s voorgeselecteerd aan de hand van data uit optische microscopie. We vergeleken de profielen van verschillende fragmenten aan de cellen ten opzichte van de celverbindingen. Als interessant resultaat werd een Ni-piek gezien, gevolgd door een aanzienlijke daling van het Ni-signaal aan zowel de cel als de cel-verbinding. Als Ni ook aanwezig is in het karrenwiel, kan men verwachten dat het Ni-signaal een piek in intensiteit heeft in het midden van de diepte aan de cel-verbinding. AFM-gebaseerde lithografie gevolgd door een C-AFM-meting, identiek aan paper A, onthulde dat er geen onderlinge verbinding van Ni aanwezig is in de fibre sheath. Met behulp van de in-situ AFM werd de diepte bepaald waarop Ni aanwezig is. Dit werk maakt deel uit van paper C (Appendix III).