The impact of cadmium stress on different leaf growth zones of Oryza sativa plants

Abstract

Rice production is one of the most important agricultural practices in South Asian countries, providing a staple food product for millions of low-income families. In addition, rice is also cultivated in southern European countries such as Italy, Spain and Greece. Whereas, rice forms a valuable source of energy, improving its concentration of iron, zinc or provitamin A (i.e. golden rice) can greatly oppose prominent human micronutrient deficiencies. Another major challenge involves preventing unwanted substances from accumulating in rice grains. In this respect, pollution of agricultural soils with cadmium (Cd) and its accumulation in rice grains can result in large detrimental effects on human health such as kidney failure, development of bone abnormalities and cancer. An unfortunate event occurred in Japan in the early twentieth century, where pollution of agricultural soils with Cd caused the itai-itai disease with the local population. Today, the dangers of Cd accumulation in crops are well-known and several cultivation measurements are installed, making sure little Cd enters the food chain. However, even low concentrations of Cd present in the soil can result in lower plant yields. After entering the plant system, Cd is known to indirectly stimulate the production of reactive oxygen species (ROS) at cellular level. Under normal circumstances, ROS function as important signaling molecules regulating plant development and growth, but an overproduction potentially results in damage to DNA, lipids and proteins. Therefore, plants have developed an extensive antioxidative defense system with enzymes such as catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX) and superoxide dismutase (SOD) and non-enzymatic metabolites like ascorbate and glutathione (GSH). Furthermore, this last molecule can serve as a precursor for the production of phytochelatins (PC) capable of binding Cd, which can be subsequently stored in vacuoles leading to a lowered toxicity. After exposure to Cd, plants are known to induce this defense mechanism, which results in an energetic trade-off for development and growth. So far, most studies have focused on the transporters responsible for root Cd uptake and how Cd eventually ends up in the rice grain. The main aim of the present study was to investigate the effect of Cd on the leaf development and growth of rice plants, focusing on the most important antioxidative players and identifying possible links with phytohormones. Oryza sativa plants from the Nipponbare variety were grown in hydroponics and exposed to 10 or 50 µM CdSO4 when the fourth leaf appeared. The long-term effects of Cd on leaf growth were studied by examining the sixth leaf, which appeared resp. 11 and 14 days after exposure depending on the Cd concentration applied (Chapter 3). By combining microscopic measurements and flow cytometric analyses of the leaf growth zone, a shortening of the leaf meristem and the cell elongation zone could be observed after Cd exposure. This consequently led to a lowered leaf elongation rate (LER) and a reduced final leaf length (FLL). Moreover, the expression levels of three cell cycle genes, retinoblastoma-related protein 2 (RBR2), cyclin-dependent kinase B1-1 (CDKB1;1) and cyclin-dependent kinase B2-1 (CDKB2;1) were downregulated across the entire leaf growth zone. Lastly, the expression levels of different CAT and APX isoforms were highly variable depending on the studied leaf segment, which suggests that regulation of oxidative stress levels also depends on the observed leaf zone. Next to determining long-term effects of Cd, a second goal was to study the leaf responses after one day of exposure (Chapter 4). After this short period, the LER already significantly decreased and high Cd concentrations were measured in the leaf growth zone. This correlated to the increased lipid peroxidation that was also shown to be Cd concentration-dependent. To counteract this early loss of the oxidative balance of the leaves, a prominent role for the GSH metabolism was revealed using gene expression analysis. The glutathione synthetase 2 gene was upregulated in the leaf growth zone, which encodes for an enzyme that produces hydroxymethylglutathione (hmGSH). In addition, the expression levels of the glutathione reductase and phytochelatin synthase 2 transcripts were higher in leaf six of Cd-exposed plants as compared to control plants and demonstrates the importance of recycling oxidized GSH molecules and PC biosynthesis. The induction of these genes was in contrast to the expression levels of CAT, APX and SOD genes, which were irresponsive. Interestingly, also the transcript levels of two pro-oxidants, the respiratory burst oxidase homolog genes RBOHB and RBOHC were increased that potentially could lead to a higher ROS production and be important in early signaling events. Moreover, after one day of Cd exposure, the concentration of the phytohormone abscisic acid (ABA) was increased in a Cd concentration-dependent manner. Together with the increased transcript levels of RBOHB and RBOHC in the leaf growth zone, the increase in ABA might lead to stomatal closure or modification of cell wall extensibility as was already described in literature. In addition, the concentration of ABA was also higher in long-term Cd-exposed Nipponbare plants than in control plants. Also after a longer period of Cd exposure, salicylic acid (SA) was elevated, which is already known in literature to stimulate the activities of antioxidants and is in agreement with our results from Chapter 3 where several CAT and APX transcripts were upregulated. The findings described in Chapters 3 and 4 were observed using the low Cd-accumulating variety Nipponbare. However, a large difference in Cd accumulation exists between rice varieties. Therefore, we investigated the long-term growth responses of six Japonica cultivars with contrasting Cd grain accumulation after exposure to 10 or 50 µM CdSO4 (Chapter 5). Shoot and root biomass reduction were variety- and Cd concentration-dependent. Furthermore, cultivars that translocated high amounts of Cd to the leaves were characterized by strongly elevated sulfur concentrations, pointing towards an important role of GSH or PC in their acclimation strategy. Moreover, significant correlations were found between the LER and lipid peroxidation and total non-enzymatic antioxidant capacity present in the leaf growth zone. Lastly, using principal component and clustering analysis, we proved that these six rice varieties display different Cd coping strategies. After exposure to 50 µM CdSO4, the varieties Nipponbare and Koshihikari clustered together because of a large increase in total antioxidative capacity and a large reduction of growth, suggesting a clear energetic trade-off between these processes. When the same varieties were exposed to 10 µM CdSO4, they formed a second cluster with the varieties Sasanishiki and Akitakomachi, characterized by the lowest Cd translocation to the leaf five and six and the lowest length reduction of the youngest leaf compared to the control. Lastly, Chiyominori and Hatakinumochi made up the third and last cluster by displaying the highest Cd translocation in leaf five and six and containing the highest sulfur concentration in leaf five, which again highlights the strong relationship between Cd and S. In Chapter 5, the high Cd-translocating variety, Hatakinumochi, displayed an intermediate biomass reduction possibly due to a higher capacity to stimulate its sulfur metabolism and hence detoxification via Cd chelation. Moreover, Hatakinumochi is an upland rice variety, characterized by a lower water demand during production, which makes it an interesting variety for future breeding programs. Climate change is putting traditional rice cultivation in paddy fields under pressure. It is expected that temporarily drying out the paddy fields will become inevitable. Unfortunately, Cd bioavailability is known to increase under oxidizing soil conditions. Therefore, a next goal was to investigate whether Hatakinumochi plants could recover from a short period of Cd exposure applied when the fourth leaf appeared (Chapter 6). The plants were returned to control conditions three days later and displayed an increased tillering, larger root fresh weight and leaf morphological changes at the time of reaching their FLL. Moreover, nutrient homeostasis was almost completely unaltered in both the root and shoot. In addition, a major role was proposed for hmGSH in combating Cd phytotoxicity and could prepare recovering plants for additional future exposures. Lastly, recovering plants displayed increased ABA and SA concentrations that could regulate plant growth and stimulate antioxidative defense responses as was already discussed before. To conclude, our results suggest that the GSH metabolism is important for combating early Cd toxicity within the leaf and a stimulation of antioxidants production such as CAT and APX is subsequently induced. Moreover, Japanese rice varieties with contrasting Cd accumulation displayed significant differences in their growth and defense response against Cd. Studying rice varieties that translocate large amounts of Cd to the leaves, such as Hatakinumochi, and investigating the defense mechanisms deployed to deal with this stress factor, can be important in the production of Cd tolerant rice varieties in the future.

Rijstproductie is een van de belangrijkste landbouwpraktijken in Zuid-Aziatische landen en vormt hierbij het belangrijkste voedselproduct voor miljoenen gezinnen met een laag inkomen. Daarnaast wordt rijst ook verbouwd in Zuid-Europese landen zoals Italië, Spanje en Griekenland. Hoewel rijst een waardevolle energiebron vertegenwoordigt, kan een verhoogde concentratie van ijzer, zink of provitamine A (zoals gouden rijst) in rijst de prominente tekortkomingen aan micronutriënten in het menselijk dieet sterk verbeteren. Een andere belangrijke uitdaging is om te voorkomen dat ongewenste stoffen zich ophopen in rijstkorrels. In dit opzicht kan vervuiling van landbouwgronden met cadmium (Cd) en vervolgens Cd-accumulatie in rijstkorrels leiden tot grote schadelijke effecten op de menselijke gezondheid, zoals nierfalen, de ontwikkeling van botafwijkingen en kanker. Een ongelukkige gebeurtenis vond plaats in Japan in het begin van de twintigste eeuw, waar vervuiling van landbouwbodems met Cd de itai-itai ziekte veroorzaakte bij de lokale bevolking. Tegenwoordig zijn de gevaren van Cd-accumulatie in gewassen bekend en worden er verschillende maatregelen genomen om ervoor te zorgen dat er weinig Cd in de voedselketen terechtkomt. Zelfs lage Cd concentraties in de bodem kunnen echter resulteren in lagere gewasopbrengsten. Nadat Cd in de plant terechtkomt, stimuleert het indirect de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) op cellulair niveau. Onder normale omstandigheden kunnen deze ROS fungeren als belangrijke signaalmoleculen die de ontwikkeling en het functioneren van planten reguleren, maar ROS overproductie leidt mogelijk tot schade aan DNA, lipiden en eiwitten. Daarom hebben planten een uitgebreid antioxidatief afweersysteem ontwikkeld met enzymen zoals catalase Bovendien kan dit laatste molecuul dienen als precursor voor de productie van fytochelatines (PC) die Cd kunnen binden en vervolgens in vacuolen kunnen worden opgeslagen, wat leidt tot een verlaagde Cd toxiciteit. Het is bekend dat planten na blootstelling aan Cd dit afweermechanisme induceren, maar hiervoor is energie nodig die anders kan gebruikt worden voor ontwikkeling en groei. Het meeste onderzoek tot op heden heeft zich gericht op de transporters die verantwoordelijk zijn voor de opname van Cd in de wortel en hoe Cd finaal in de rijstkorrel terechtkomt. Het belangrijkste doel van deze doctoraatstudie was om het effect van Cd op de bladgroei van rijstplanten te onderzoeken, met een focus op antioxidatieve spelers en het vinden van mogelijke verbanden met fytohormonen. Oryza sativa planten van de variëteit Nipponbare werden gekweekt in hydrocultuur en blootgesteld aan 10 of 50 µM CdSO4 wanneer het vierde blad verscheen. De langetermijneffecten van Cd op de bladgroei werden bestudeerd door het zesde blad te onderzoeken, dat afhankelijk van de Cd-concentratie resp. 11 en 14 dagen na blootstelling verscheen (Hoofdstuk 3). Door microscopische metingen en flowcytometrische analyse van de bladgroeizone te combineren, kon een verkorting van het bladmeristeem en de cel-elongatiezone worden vastgesteld na blootstelling aan Cd. Dit leidde bijgevolg tot een verlaagde bladverlenging (LER) en uiteindelijk ook tot een verminderde finale bladlengte (FLL). Bovendien waren de expressieniveaus van drie celcyclusgenen, retinoblastoma-related protein 2 (RBR2), cyclin-dependent kinase B1-1 (CDKB1;1) en cyclin-dependent kinase B2-1 (CDKB2;1) verlaagd over de ganse bladgroeizone. Tenslotte waren de expressieniveaus van verschillende CAT en APX isovormen zeer variabel naargelang het bestudeerde bladsegment, wat suggereert dat het reguleren van oxidatieve stressniveaus sterk afhankelijk is van de geobserveerd bladzone. Naast het onderzoeken van de langetermijneffecten van Cd, was een tweede doel het bestuderen van de bladresponsen na één dag Cd-blootstelling (Hoofdstuk 4). Na deze korte periode nam de bladverlenging al significant af en werden hoge Cd-concentraties gemeten in de bladgroeizone. Dit is in overeenstemming met de verhoogde lipidenperoxidatie die bovendien afhankelijk bleek te zijn van de Cd-concentratie. Om deze vroege verstoring van het oxidatieve evenwicht in de bladeren tegen te gaan, werd een prominente rol voor het GSH-metabolisme ontdekt, gebruik makende van genexpressie analyse. De expressie van het glutathione synthetase 2 gen, wat codeert voor een enzym dat hydroxymethylglutathion (hmGSH) produceert, was verhoogd in de bladgroeizone van Cd-blootgestelde planten. Bovendien was het expressieniveau van glutathione reductase en phytochelatin synthase 2 transcripten eveneens verhoogd, wat het belang van het recycleren van geoxideerde GSH moleculen en PC biosynthese aantoont. Daartegenover bleven de expressieniveaus van CAT, APX en SOD genen onveranderd. Interessant was ook dat de transcriptieniveaus van twee pro-oxidatieve genen, namelijk respiratory burst oxidase homolog B (RBOHB) en RBOHC, waren verhoogd. Dit zou kunnen leiden tot een hogere ROS productie, die belangrijk kan zijn bij vroege signaleringsmechanismen. Bovendien was na één dag Cd-blootstelling de concentratie van het fytohormoon abscisinezuur (ABA) op een Cd-concentratieafhankelijke manier verhoogd. Samen met de verhoogde transcriptieniveaus van RBOHB en RBOHC in de bladgroeizone, zou de toename van ABA kunnen leiden tot een sluiting van de huidmondjes of een modificatie van de rekbaarheid van de celwand, zoals al eerder in de literatuur werd beschreven. Bovendien werd de concentratie van ABA ook gemeten in Nipponbare planten die langdurig werden blootgesteld aan Cd en ook hier bleek het niveau hoger te zijn dan dat van controleplanten. Ook na een langere periode van Cd-blootstelling, was het gehalte aan salicylzuur (SA) verhoogd. Hiervan is in de literatuur reeds beschreven dat het de activiteiten van antioxidanten stimuleert tijdens stress wat in overeenstemming is met onze resultaten uit Hoofdstuk 3 waar het niveau van verschillende CAT- en APX-transcripten was verhoogd. De bevindingen beschreven in Hoofdstuk 3 en 4 zijn geobserveerd in de laag Cd-accumulerende variëteit Nipponbare. Er bestaat echter een groot verschil in Cd-accumulatie tussen verschillende rijstvariëteiten. Daarom onderzochten we de groeirespons op lange termijn van zes Japonica cultivars met contrasterende Cd-accumulatie in de rijstkorrels na blootstelling aan 10 of 50 µM CdSO4 (Hoofdstuk 5). De reductie van scheut- en wortelbiomassa was afhankelijk van de bestudeerde rijstvariëteit en de Cd-concentratie. Bovendien werden cultivars die grote hoeveelheden Cd naar de bladeren transporteerden, gekenmerkt door sterk verhoogde zwavelconcentraties, wat mogelijks wijst op een belangrijke rol voor GSH of PC. Bovendien werden significante correlaties gevonden tussen de LER, lipidenperoxidatie en de totale niet-enzymatische antioxidatieve capaciteit in de bladgroeizone. Met behulp van principale componenten en clusteringanalyse toonden we aan dat deze zes rijstvariëteiten verschillende overlevingsstrategieën vertonen aan Cd stress. Na blootstelling aan 50 µM CdSO4, vormden de variëteiten Nipponbare en Koshihikari een cluster vanwege een grote toename van het totale antioxidatieve vermogen en een grote afname van de groei, wat duidt op een duidelijke energetische trade-off tussen deze processen. Wanneer dezelfde variëteiten werden blootgesteld aan 10 µM CdSO4, vormden ze een tweede cluster met de variëteiten Sasanishiki en Akitakomachi, gekenmerkt door de laagste Cd-translocatie naar het blad vijf en zes en de laagste lengtevermindering van het jongste blad vergeleken met de controle. Tenslotte vormden Chiyominori en Hatakinumochi de derde en laatste cluster. Ze vertoonden de hoogste Cd-concentraties in blad vijf en zes en de hoogste zwavelconcentratie in blad vijf, wat opnieuw de sterke relatie tussen Cd en S benadrukt. In Hoofdstuk 5 vertoonden de Hatakinumochi rijstplanten, een variëteit die hoge Cd concentraties kan opnemen en transloceren, een intermediaire biomassareductie na blootstelling aan Cd. Dit is waarschijnlijk gekoppeld aan zijn vermogen om het zwavelmetabolisme te induceren. Hatakinumochi is een upland rijstvariëteit, die wordt gekenmerkt door een lagere watervereiste tijdens de productie, waardoor het een interessante variëteit is voor toekomstige veredelingsprogramma's. De klimaatverandering zet de traditionele rijstteelt in rijstvelden onder druk. Verwacht wordt dat het tijdelijk uitdrogen van de rijstvelden op termijn onvermijdelijk zal worden. Het is echter geweten dat de biologische beschikbaarheid van Cd toeneemt onder oxiderende bodemomstandigheden. Daarom was een volgend doel van dit doctoraatsproject om te onderzoeken of Hatakinumochi planten konden herstellen van een korte periode van Cd-blootstelling op het moment dat het vierde blad verscheen (Hoofdstuk 6). De planten werden drie dagen later terug onder controlecondities gebracht en vertoonden een verhoogde laterale scheutuitloop, een groter wortelgewicht en bladmorfologische veranderingen op het moment dat ze de FLL bereikten. Bovendien was de homeostase van nutriënten bijna volledig ongewijzigd in zowel de wortel als de scheut. Tevens werd een belangrijke rol voorgesteld voor hmGSH bij het bestrijden van Cd-fytotoxiciteit en zou het herstellende planten kunnen voorbereiden op toekomstige blootstellingen. Tenslotte bevatten deze herstellende planten eveneens verhoogde ABA- en SA-concentraties die de plantengroei konden reguleren en antioxidatieve afweerreacties konden stimuleren. Om te concluderen suggereerden onze resultaten dat het GSH-metabolisme belangrijk is voor het bestrijden van vroege Cd-toxiciteit in het blad en dat een stimulatie van de productie van antioxidanten zoals CAT en APX later wordt geïnduceerd. Bovendien vertoonden Japanse rijstvariëteiten met een contrasterende Cd-accumulatie significante verschillen in hun groei en verdedigingsreactie tegen Cd. Het bestuderen van rijstvariëteiten die grote hoeveelheden Cd naar de bladeren verplaatsen, zoals Hatakinumochi, en het onderzoeken van de verdedigingsmechanismen die worden ingezet om met Cd stress om te gaan, zou in de toekomst belangrijk kunnen zijn bij de productie van Cd-tolerante rijstvariëteiten. (CAT), ascorbaatperoxidase (APX) en superoxidedismutase (SOD) en niet-enzymatische metabolieten zoals ascorbaat en glutathion (GSH).