Synthesis and Characterization of Nucleobase Functionalized Polymers: Towards Coding along a Carbon Backbone

Abstract

DNA is an interesting biopolymer which keeps triggering researchers to dive deeper into the pool of its characteristics. Besides the analysis of its properties, mimicking, manipulating or improving the molecular structure of Nature’s most valuable building block is one of the top research areas investigated by the scientific community. Synthesis of oligomers and polymers bearing nucleobase functionalities is one method to achieve this goal. With the development of reversible deactivation radical polymerization (RDRP) techniques, pathways opened towards synthetic procedures whereby nucleobase functionalized monomers can be arranged into desired (block)sequences. This thesis explores a synthetic route towards multiple hydrogen bond sequence-defined oligomers where the combination of reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization and intermediate flash column purification is the key to a successful strategy. In parallel with this main goal, NMR based characterization methods are developed in order to obtain information on the hydrogen bonding characteristics of these synthetic DNA analogues. In the first part, the synthesis of nucleobase functionalized monomers was described as these monomers are the starting materials of the final oligomers. Adenine, thymine, uracil and cytosine acrylate monomers were synthesized via aza-Michael addition between 1,4-butanediol diacrylate and the pure nucleobase. Optimizations were made to achieve acceptable yields (45-68%) with only one reaction step. However, this strategy could not be extended to the guanine acrylate monomer where direct addition of the diacrylate onto the low reactive guanine unit resulted in isomeric side products and only low yields could be achieved (max 5%). To avoid these drawbacks, a new synthetic procedure was developed starting from the almost identical 2-amino-6-chloropurine. Aza-Michael addition with 1,4-butanediol diacrylate followed by a nucleophilic substitution in a HCOOH/H2O (80/20) mixture resulted in pure guanine acrylate monomer (33% overall yield). The synthesized monomers were polymerized via RAFT to demonstrate compatibility with RDRP. All monomers except guanine functionalized acrylate achieved expected conversions between 75-85%, in contrast with a conversion of 25% for guanine. In the second part, the focus shifted from synthetic procedures to characterization methods. Determining binding characteristics between synthetic nucleobase derivatives becomes an essential part when using these multiple hydrogen bonding materials in future biomedical applications. The combination of conventional 1H-NMR with more advanced NOE and DOSY measurements revealed interesting intermolecular binding behaviours between free nucleobase functionalized monomers and polymers. Each method offered a different piece of information. 1H-NMR experiments illustrated the influence of temperature and solvent on the hydrogen bonding between the nucleobase functionalized monomers. Also, no difference in selectivity between complementary and noncomplementary counterparts was observed. NOE measurements confirmed this phenomenon and even delivered more information on the specific nucleobase complexes that where formed. Besides the conventional Watson-Crick conformation, Hoogsteen interactions were also detected in the A-T base pair. DOSY measurements were performed to characterize the nucleobase interaction in these larger molecules. In parallel with 1H-NMR and NOE analysis, no selective behaviour was detected as common diffusion coefficients between both complementary and non-complementary pairs were calculated. A major factor contributing to this “non-selective” behaviour in synthetic nucleobase functionalized materials is the high degree of freedom of the hydrogen bonding group. In the final part, a method to synthesize sequence-defined nucleobase functionalized oligomers was developed. A combination of single monomer insertions via RAFT and intermediate flash column purification yielded sequence defined di-, tri-, and tetramers with a predefined nucleobase sequence. In a first development step, the operating conditions of the flash column system were optimized by separation of uracil oligomers (0 to 5 monomer insertions). Next, an adenine (AAAA) and an alternating adenine/cytosine (ACAC) tetramer were synthesized and purity and identity of the compounds were proven by 1H-NMR spectroscopy and MALDI-TOF mass spectrometry. As a last step in the process, a multiple hydrogen bond sequence-defined tetramer bearing all four nucleobases (ACTG) was synthesized according to this strategy. An extra run on the flash column was necessary after the third monomer insertion (thymine) to obtain a sufficient amount for a subsequent reaction. Nevertheless, a sequence-defined material bearing all four nucleobases was synthesized for the first time with complete freedom over the monomer sequence.

DNA is een interessant biopolymeer dat onderzoekers blijft prikkelen om steeds dieper in de poel van karakteristieken te duiken. Naast de analyse van deze eigenschappen is het imiteren, manipuleren en verbeteren van de structuur één van de top onderzoeksgebieden. Synthese van oligomeren en polymeren die nucleobase-functionaliteiten bevatten is één van de methodes om dit doel te bereiken. De ontwikkeling van RDRP-technieken opende mogelijkheden naar synthetische procedures die nucleobase gefunctionaliseerde monomeren kunnen ordenen in een vooraf bepaalde sequentie. Deze doctoraatsthesis onderzoekt een synthetische route om waterstofbindende sequentie-gedefinieerde oligomeren te produceren waarbij de combinatie van RAFT-polymerisatie en intermediaire zuivering met flash kolom technieken de sleutel naar succes is. Parrallel met dit hoofddoel worden NMR-gebaseerde analysetechnieken ontwikkeld om informatie over de waterstofbindende eigenschappen van deze synthetische DNA-analogen te verkrijgen. In het eerste deel wordt de synthese van nucleobase-gefunctionaliseerde monomeren beschreven. Dit zijn de startmaterialen om de finale oligomeren te verkrijgen. Adenine, thymine, uracil en cytosine acrylaat monomeren werden gesynthetiseerd door middel van een aza-Michael-additie tussen 1,4-butaandiol diacrylaat en de zuivere nucleobase. Reactieprotocollen werden geoptimaliseerd waarbij aanvaardbare rendementen (45-68%) werden behaald in slechts één enkele reactiestap. Deze strategie kon niet worden toegepast op guanine waar er geen directe additie mogelijk was omwille van de lage reactiviteit van de nucleobase en de vorming van moeilijk te zuiveren isomeren. Om deze problemen te omzeilen, werd er een nieuwe procedure ontwikkeld startende van het bijna identieke 2-amino-6-chloorpurine. Aza-Michael additie met 1,4-butaandiol diacrylaat gevolgd door een nucleofiele substitutie in een HCOOH/H2O (80/20) mengsel resulteerde in het zuiver guanine-gefunctionaliseerde acrylaat (33% globaal rendement). Om de compatibiliteit met RDRP-technieken te demonstreren werden deze monomeren gepolymeriseerd via RAFT-polymerisatie. Alle monomeren buiten het guanine-acrylaat behaalde de verwachte conversies tussen 75-85% in tegenstelling tot een conversie van 25% voor het guanine monomeer. Vervolgens verschoof de focus in het tweede deel van de synthetische procedures naar de analysemethoden. Het bepalen van de bindingseigenschappen tussen synthetische nucleobase-gefunctionaliseerde materialen krijgt een belangrijke rol wanneer deze waterstofbindende moleculen worden gebruikt in toekomstige biomedische applicaties. De combinatie van conventionele 1H-NMR met geavanceerde NOE en DOSY-metingen bracht belangwekkende informatie aan het licht betreffende de intermoleculaire bindingseigenschappen van vrije nucleobase gefunctionaliseerde monomeren en polymeren. Elke techniek zorgt voor zijn stukje van de puzzel. 1H-NMR metingen bevestigd de invloed van temperatuur en solventkeuze op de waterstofbindingen. Ook werd er geen verschil in selectiviteit tussen complementaire en niet complementaire nucleobase monomeren vastgesteld. NOE metingen bevestigd deze vaststelling en gaven zelfs meer informatie over de gevormde nucleobase complexen. Naast de conventionele Watson-Crick conformatie werden ook Hoogsteen-interacties waargenomen in het A-T basepaar. De waterstofbindingen in polymeren werden geanalyseerd met DOSY-metingen. Ook hier werd een niet-selectief karakter vastgesteld doordat er een gemeenschappelijke diffusiecoëfficiënt werd bekomen tussen zowel complementaire als niet-complementaire polymeren. De hoge vrijheidsgraad van de functionele groepen die zorgen voor waterstofbindingen is de grootste factor die bijdraagt tot dit niet selectieve karakter. In het laatste deel werd een methode ontwikkeld om sequentie-gedefinieerde nucleobase-gefunctionaliseerde oligomeren te synthetiseren. Door een combinatie van één enkele monomeerinsertie via RAFT-polymerisatie en intermediaire flash kolom zuivering was het mogelijk om sequentie-gedefinieerde di-, tri- en tetrameren te synthetiseren met een vooraf bepaalde nucleobase-sequentie. In een eerste stap in de ontwikkeling werden de condities van de flash kolom geoptimaliseerd door het zuiveren van een uracil-oligomeermengsel (0 tot 5 monomeerinserties). Vervolgens werd er een adenine (AAAA) en alternerend adenine/cytosine (ACAC) tetrameer gesynthetiseerd waarbij de zuiverheid werd bewezen met 1H-NMR en MALDI-TOF metingen. Als laatste stap werd er een waterstofbindend sequentie-gedefinieerd tetrameer geproduceerd dat alle vier de nucleobasen bevat in een vooraf bepaalde volgorde. Een extra run op de flash kolom was nodig na de insertie van het derde monomeer (thymine) om een voldoende hoeveelheid te verkrijgen voor een volgende reactie. Desalniettemin werd er voor de allereerste keer een sequentie-gedefinieerd tetrameer gesynthetiseerd dat alle vier de DNA nucleobasen bevat met volledige vrijheid over de volgorde van de monomeren.