A novel diagnostic mCRP ALISA assay for the detection of chronic inflammation diseases

Abstract

An elevated C-reactive protein (CRP) level in plasma has long been used in clinical practice as a significant risk predictor for inflammatory diseases such as cardiovascular diseases. CRP is an acute-phase protein that rapidly raises its concentration from low to undetectable levels to a thousand-fold rise in healthy individuals following acute inflammation (e.g., infection). CRP exerts its proinflammatory function through its monomeric isoform (mCRP) rather than the wellknown pentameric form (pCRP). Notably, in contrast to pCRP, mCRP is also a potent activator of endothelial cells and neutrophils. Moreover, mCRP regulates the complement pathway activation and LDL metabolism in a more efficiently than pCRP. Based on all observations, it became clear that mCRP exhibits potent proinflammatory activities, whereas pCRP rather possesses anti-inflammatory properties and/or may serve as a precursor of mCRP. Therefore, we hypothesized that mCRP is a sensitive indicator for the detection of early inflammation in patients suffering from chronic inflammation-associated diseases. So far, the current standard method for CRP detection for clinical purposes has been mostly performed using commercially available antibodies-based assays such as the highly sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (hsELISA). Some of these antibodies can bind to both isoforms of CRP (pCRP and mCRP), but the lack of a reliable mCRP specific assay has limited the validation of this biomarker in different inflammationassociated diseases. In this study, we aimed to develop a diagnostic tool that specifically detects mCRP, using an aptamer-based approach and to develop an Aptamer-Linked Immobilized Sorbent Assay (ALISA) as a robust quantification tool to detect and quantify mCRP in human serum. The first initial step to achieve the main objective was to characterize and to evaluate the currently available antibodies against mCRP. In chapter 2, the specificity of the two non-commercial antibodies 3H12 and 9C9 developed against a mutated, recombinant mCRP by Prof. L. Potempa, Roosevelt University, Chicago and a commercially available antibody CRP8 were evaluated. First, these antibodies were analyzed for their binding affinity, specificity and stability using Surface Plasmon Resonance. Based on these results, the antibody 3H12 has a higher specificity for mCRP but turned out to be unstable upon immobilization and regeneration, thereby gradually losing its binding affinity for mCRP. The CRP8 antibody has a higher affinity for mCRP but does also bind pCRP. As such, the available antibodies are no reliable candidates to develop a mCRP assay that could specifically detect mCRP in the presence of pCRP like in human serum. In chapter 3, the in-house developed aptamers (AmC2, AmC3, AmC4) selected against native human mCRP by an optimized SELEX procedure were evaluated as an alternative to the available antibodies. Again, the binding affinity, specificity and stability were analyzed using Surface Plasmon Resonance and Capillary Electrophoresis. The kinetic parameters such as association and dissociation constants were evaluated and compared with the characterized antibody 3H12. The AmC2 aptamer showed the highest affinity and specificity and was fully stable upon immobilization and regeneration. Therefore, the selected AmC2 aptamer was used to design and to develop a robust and reliable diagnostic tool called an AptamerLinked Immobilized Sorbent Assay (ALISA). In chapter 4, the applicability of the developed ALISA as a diagnostic tool was explored. As a proof of principle, this novel test was first applied to determine mCRP levels in the cell culture supernatant derived from inflammation-induced endothelial cells, being an in vitro vascular endothelial model system for studying inflammation responses in analogy to chronic inflammatory diseases. Next, as a proof of application, this test was applied to serum samples of different independent patient cohorts of inflammation-associated diseases including obese healthy controls (n=28), Rheumatoid Arthritis (RA) patients (n=30) in comparison to healthy controls (n=43), Major mood depressive disorder (n= 35) in comparison to healthy control (n=45) and the chronic obstructive pulmonary disease (COPD) (n=40) with age, gender-matched healthy controls (n=20). In all these patient cohorts, we observed significant differences in serum mCRP concentration as compared to control populations. Overall, this ALISA assay offers a novel, low-cost diagnostic platform for the reliable detection of mCRP in human serum of patients with systemic inflammation. Moreover, this assay provides an important tool to monitor these diseases and may serve to guide therapeutic decisions. In the future, this tool can also be applied to further explore the function of mCRP and its role in inflammationrelated disorders. In chapter 5, the role of mCRP in extracellular vesicles is explored. The main aim is to address the question whether mCRP carrying EV can serve as a potential sentinel marker for early inflammation. In this study, endothelial cells (HUVEC) were cultivated either unstimulated or triggered for inflammation by TNF-α. EV were isolated from the supernatant of both conditions using size exclusion chromatography. Different tools such as immunofluorescence assays, western blot, TEM and NTA analysis were performed to characterize and to confirm successful isolation of EV from both conditions. The presence of mCRP on inflamed EV was investigated using our developed mCRP ALISA, SPR and western blot analysis. We demonstrated that inflamed EV do carry mCRP and may deliver this to untreated HUVEC cells triggering a pro-inflammatory status in this recipient cell. Our current study confirms that the circulating EV have a great potential as a sentinel biomarker in early inflammation. This study also opens up the opportunity to develop a reliable, reproducible and robust approach to detect circulating mCRP EV in a diagnostic application. In the last chapter 6, the results of the thesis are discussed in relation to the current international knowledge on mCRP. In addition, future applications of this technology are discussed. To conclude, the major aim of this thesis to develop an optimized and robust diagnostic tool to efficiently quantify mCRP in serum samples is achieved. The developed ALISA assay was applied in several chronic inflammation-related diseases and we showed a significantly elevated level of mCRP as compared to healthy controls, clearly indicating the potential of mCRP as a low-grade systemic chronic inflammatory biomarker. Therefore, the developed ALISA tool opens new opportunities to explore some of the as-yet-unknown mCRP activation mechanisms and their role in the inflammatory process.

Een verhoogd niveau van C-reactief eiwit (CRP) in plasma wordt in de klinische praktijk al lang gebruikt als een belangrijke risicovoorspeller voor ontstekingsziekten zoals hart- en vaatziekten. CRP is een acuut fase eiwit waarvan de concentratie snel verhoogt van een laag niveau tot een duizendvoudige stijging bij gezonde personen na een acute ontsteking (bijv. een infectie). CRP oefent zijn pro-inflammatoire functie uit via zijn monomere isovorm (mCRP) in plaats van de alom gekende pentamere vorm (pCRP). In tegenstelling tot pCRP is mCRP ook een krachtige activator van endotheelcellen en neutrofielen. Bovendien regelt mCRP de activatie van de complement pathway en het LDL-metabolisme op een efficiëntere en flexibelere manier dan pCRP. Op basis van deze observaties werd duidelijk dat mCRP krachtige pro-inflammatoire activiteiten vertoont, terwijl pCRP eerder ontstekingsremmende eigenschappen bezit en/of als voorloper van mCRP kan dienen. Deze vaststellingen leiden tot de hypothese dat mCRP een gevoelige indicator is voor de detectie van vroege systemische ontstekingreacties bij patiënten die lijden aan chronische ontstekingsgerelateerde ziekten. De huidige standaardmethode voor CRP-detectie voor klinische doeleinden bestaat uit commercieel verkrijgbare ELISA kits gebaseerd opp antilichamen, zoals bijvoorbeeld de CRP “high sensitive enzyme-linked immunosorbent assay” (hsELISA). Sommige van deze antilichamen binden beide isovormen van CRP (pCRP en mCRP), maar het ontbreken van een betrouwbare mCRP-specifieke assay heeft de validatie van deze biomarker in verschillende ontstekingsgerelateerde ziekten beperkt. Deze studie heeft als doel de ontwikkeling van een diagnostische assaydie specifiek mCRP detecteert, ook in een pCRP-achtergrond zoals in serum. Hiervoor wordt een op aptameren gebaseerde aanpak ingezet omin een Aptamer-Linked Immobilized Sorbent Assay (ALISA) te ontwikkelen die het mogelijk maakt om op een betrouwbare manier mCRP in menselijk serum te detecteren en te kwantificeren. De eerste stap om het hoofddoel te bereiken was het karakteriseren en evalueren van de momenteel beschikbare antilichamen tegen mCRP. In hoofdstuk 2 werden twee niet-commerciële antilichamen, ontwikkeld tegen een gemuteerd, recombinant mCRP door Prof. L. Potempa van de Roosevelt University in Chicago en een commercieel beschikbaar antilichaam CRP8 geëvalueerd. Eerst werden deze antilichamen geanalyseerd op hun bindingsaffiniteit, specificiteit en stabiliteit met behulp van Surface Plasmon Resonance. Op basis van deze resultaten konden we aantonen dat het antilichaam 3H12 een hoge specificiteit heeft voor mCRP, maar het bleek onstabiel te zijn bij immobilisatie en meer nog bij regeneratie waardoor het geleidelijk zijn bindingsaffiniteit voor mCRP verliest. Het commerciële CRP8 antilichaam heeft een hogere affiniteit voor mCRP, maar bindt echter ook in hoge mate aan pCRP. Als zodanig zijn de beschikbare antilichamen (commerciëel of nietcommercieel) geen goede kandidaten om een mCRP-test te ontwikkelen die specifiek mCRP kan detecteren in de aanwezigheid van pCRP zoals in menselijk serum. In hoofdstuk 3 werden de in huis ontwikkelde aptameren (AmC2, AmC3, AmC4), die door ons geselecteerd werden tegen natuurlijk menselijk mCRP via een geoptimaliseerde SELEX procedure, geëvalueerd als alternatief voor de beschikbare antilichamen. Opnieuw werd de bindingsaffiniteit, specificiteit en stabiliteit geanalyseerd met behulp van “Surface Plasmon Resonance” en Capillaire Electroforese. De kinetische parameters zoals de associatie- en dissociatieconstanten werden geëvalueerd en vergeleken met het gekarakteriseerde antilichaam 3H12. Het AmC2 aptamer vertoonde de hoogste affiniteit en specificiteit en was volledig stabiel zowel bij immobilisatie en regeneratie. Daarom werd het AmC2 aptamer geselecteerd om een robuust en betrouwbaar diagnostisch hulpmiddel te ontwerpen en te ontwikkelen, meer specifiek een Aptamer-Linked Immobilized Sorbent Assay (ALISA). In hoofdstuk 4 is de toepasbaarheid van de ontwikkelde ALISA als diagnostisch hulpmiddel onderzocht. Als “proof of principle” werd deze nieuwe test eerst toegepast om de mCRP-niveaus te bepalen in het supernatant van endotheelcellen die in celkweek werden gestimuleerd tot een inflammatoire conditie met behulp van TNF-α. Dit celsysteem betreft tevens een in-vitromodelsysteem voor chronische (cardio)vasculaire ontstekingsziekten. Vervolgens werd de test, als ”proof of application”, toegepast op serum van verschillende onafhankelijke patiëntcohorten met ontstekingsgerelateerde ziekten, waaronder obese gezonde controles (n=28), reumatoïde artritis (RA) patiënten (n=30) in vergelijking met gezonde controles (n=43), majeure depressie (n=35) in vergelijking met gezonde controles (n=45) en chronische obstructieve longziekte (COPD) (n=40) met leeftijd en geslacht gematchte gezonde controles (n=20). In al deze patiëntencohorten constateerden we significante verschillen in de serum mCRP-concentraties in vergelijking met de controlepopulaties. In het algemeen biedt deze ALISA-test een nieuw en goedkoop diagnostisch platform voor de betrouwbare detectie van mCRP in menselijk serum van patiënten met systemische ontsteking ongeacht de pCRP concentratie in het aanwezig in het serum. Bovendien biedt deze test een belangrijk instrument om deze ziekten op te volgen en kan het mogelijk dienen als leidraad voor therapeutische beslissingen. In de toekomst kan het ook worden toegepast voor de studie van de functie van mCRP en zijn rol bij het ontstaan van ontstekingsgerelateerde aandoeningen. In hoofdstuk 5 werd de rol van mCRP in extracellulaire vesikels (EV) onderzocht. De belangrijkste onderzoeksvraag hier is of mCRP bevattende EV kunnen dienen als potentiële sentinel-markers voor een vroege ontsteking. In deze studie werden endotheelcellen (HUVEC) gekweekt, hetzij zonder stimulans, hetzij getriggerd voor ontsteking door TNF-α. EV werden uit het supernatant van beide condities geïsoleerd met behulp van chromatografie. Verschillende analyses zoals immunofluorescentie assays, western blot, TEM en NTA-analyses werden uitgevoerd om de succesvolle isolatie van EV te bevestigen en deze EV te karakteriseren. De aanwezigheid van mCRP op tEV afkomstig van cellen na stimulatie met TNF-α werd aangetoond door middel van de door ons ontwikkelde mCRP ALISA, SPR en Western blot analyse. We hebben verder ook aangetoond dat deze tEV mCRP kunnen afleveren aan onbehandelde HUVEC-cellen en vervolgens een pro-inflammatoire status in deze recipiënt cellen veroorzaken. Onze huidige studie bevestigt dat deze circulerende EV een groot potentieel hebben als “schildwacht” bij een vroege ontsteking. Deze studie opent ook de mogelijkheid om een betrouwbaar, reproduceerbaar en robuust instrument te ontwikkelen om circulerende mCRP-EV te detecteren en te isoleren voor verdere diagnostische toepassingen. In het laatste hoofdstuk 6 worden de resultaten van het proefschrift besproken in relatie tot de huidige internationale kennis over mCRP. Daarnaast worden toekomstige toepassingen van deze technologie besproken. Tot slot werd het belangrijkste doel van dit proefschrift, namelijk het ontwikkelen van een geoptimaliseerde en robuuste diagnostische assay voor het efficiënt kwantificeren van mCRP in serum bereikt. De ontwikkelde ALISA werd toegepast bij verschillende chronische ontstekingsgerelateerde ziekten en we toonden een significant verhoogd niveau van mCRP in vergelijking met gezonde controles, wat duidelijk wijst op het potentieel van mCRP als een hoogwaardige chronische inflammatoire biomarker in deze ziekten. Daarom opent de ontwikkelde ALISA-assay ook nieuwe mogelijkheden om de nog onbekende mCRP-activeringsmechanismen en de rol ervan in het ontstaan van ontstekingsgerelateerde ziektes verder te onderzoeken.