The glycine receptor alpha 2 subunit in striatal development

Abstract

Development of the CNS in humans starts early in the embryogenesis. This complex process is highly coordinated and one of the most fascinating results of millions of years of evolution. We can all appreciate the complexity of our own functioning nervous system, whether it is our senses, thoughts or movements. As complex as our nervous system is, it starts out as a simple streak of cells early in the embryo. The path from this simple structure that we call the ‘neural plate’ to a full functioning nervous system is long and complicated. The processes that coordinate the neural development are both of a pre-programmed genetic nature and factors in the extracellular environment. Understanding these processes are of great importance because these may be crucial in preventing or treating neurological disorders. Within this thesis, we will focus on the Glra2 gene and its protein, the glycine receptor alpha 2 subunit and how this might be involved in the neurodevelopmental processes. The glycine receptor is a ligand gated ion channel which is permeable to chloride (and the monovalent anion bicarbonate). The receptor is structured as a pentameric protein that spans the plasma membrane, with a central pore, an extracellular domain, an intracellular domain and a transmembrane domain. The extracellular domain is responsible for its ligand binding properties. The ligands, that will open the central pore after binding, can be taurine, alanine and glycine (other ligands have also been identified). As mentioned, the receptor is composed by five subunits which can be either all alpha subunits (homomeric) or alpha and beta subunits (heteromeric). There are four different alpha subunits (1, 2, 3 and 4) and one beta subunit (the alpha 4 subunit is not functional in humans). The composition of the subunits determines the kinetics of the receptor. Additionally, the presence of glycine receptors (and its subunit composition) also differs from cell types/structures in the CNS. As mentioned before, this research focusses on the glycine receptor alpha 2 subunit. The GlyRα2 subunit has been often described as crucial for proper neuronal developmental processes and is most abundant during early development. The work of Avila et al. showed a clear link between the GlyRα2-subunit and the migration of interneurons from the medial ganglionic eminence to the cortical layers in embryos. Morelli et al. showed that the excitation/inhibition balance in the cortex was affected in GlyRα2-KO mice. One of the mechanisms by which the glycine receptor mediates its effects in early development is by causing an efflux of chloride ions. Generally, in adult of fully developed neurons, chloride channel opening will cause an influx of the ion and a subsequent hyperpolarization. However, in developing neurons, the concentration of chloride intracellular will cause an outward driving force when GlyRs open. This depolarisation, and its downstream calcium-dependent effects, were linked with interneuronal migration and cortical progenitor proliferations by Avila et al. Based upon these previous work we focused this work on the GlyRα2 subunit in medium spiny neuron (MSN) development. MSNs are the principal neurons of the striatum. The striatum is the primary input site of the basal ganglia, a set of brain nuclei, important for voluntary movements and motor learning. Its main input structures are the thalamus and the cortex. The developmental origin of the MSNs is the lateral ganglionic eminence (LGE). In mice, the LGE produces MSNs from embryonic day 11.5 after which they migrate radially to from the striatum. What we showed (Chapter 4) here for the first time, are LGE neuroblasts with immunoreactivity for glycine receptors. Additionally, we found the LGE to be abundant with Glra2 and Glrb mRNA. When looking for the effect of an absent GlyRα2 subunit in the postnatal to adult striatum and the MSNs, we saw reduced amount of MSNs, from P0 to adult striatum in GlyRα2-KO mice. Looking closer at the embryonic LGE by using mitotic markers, we saw reduction of mitotic cells in GlyRα2-KO mice at E13.5 and an increase of mitotic cells at E16.5 in GlyRα2-KO mice. This could implicate a delay in proliferation of MSN from the LGE. However, at P0, we still found reduced number of MSNs in the striatum of GlyRα2-KO mice so this delay is not compensated for. At E13.5 we saw reduced downstream calcium related effects (CREB/pCREB) in GlyRα2-KO mice, which was not the case at E16.5. Although this also coincides with our data about the NKCC/KCC protein expression, we can only hypothesize that the absence of the GlyRα2 subunit contributes to a reduction of CREB activation which could contribute to the observed proliferation defects in GlyRα2-KO mice. After partially explaining morphological observed defects in GlyRα2-KO mice striatum (also those observed by Avila et al.) we looked for physiological (Chapter 5) defects in the postnatal striatum (with a deeper focus on the dorsal striatum). We found a GlyR-dependent effect on neonatal spontaneous activity of dorsal striatum medium spiny neurons (MSNs) and maturation of the incoming glutamatergic innervation (interestingly from the cortical layer V which had many deficits as shown by Morelli et al). Our data demonstrate that functional GlyRs are highly expressed in MSNs of one-week-old mice. Spontaneous activity and the frequency of miniature AMPA receptor-mediated currents in MSNs was also reduced in GlyRα2-KO mice. The glutamatergic synapses in MSNs remain functionally underdeveloped in adult GlyRα2-KO mice. This reduction in spontaneous activity and glutamatergic signaling can attribute to the observed changes in neonatal behavioural phenotypes as seen in ultrasonic vocalizations and righting reflex. This deficit is a consequence of impaired development of the neuronal circuitry since acute inhibition of GlyRs by strychnine in adult MSNs does not affect the properties of glutamatergic synapses. These results demonstrate that GlyR-mediated signaling supports neonatal spontaneous MSN activity and, in linked with interneuronal migration and cortical progenitor proliferations by Avila et al. Based upon these previous work we focused this work on the GlyRα2 subunit in medium spiny neuron (MSN) development. MSNs are the principal neurons of the striatum. The striatum is the primary input site of the basal ganglia, a set of brain nuclei, important for voluntary movements and motor learning. Its main input structures are the thalamus and the cortex. The developmental origin of the MSNs is the lateral ganglionic eminence (LGE). In mice, the LGE produces MSNs from embryonic day 11.5 after which they migrate radially to from the striatum. What we showed (Chapter 4) here for the first time, are LGE neuroblasts with immunoreactivity for glycine receptors. Additionally, we found the LGE to be abundant with Glra2 and Glrb mRNA. When looking for the effect of an absent GlyRα2 subunit in the postnatal to adult striatum and the MSNs, we saw reduced amount of MSNs, from P0 to adult striatum in GlyRα2-KO mice. Looking closer at the embryonic LGE by using mitotic markers, we saw reduction of mitotic cells in GlyRα2-KO mice at E13.5 and an increase of mitotic cells at E16.5 in GlyRα2-KO mice. This could implicate a delay in proliferation of MSN from the LGE. However, at P0, we still found reduced number of MSNs in the striatum of GlyRα2-KO mice so this delay is not compensated for. At E13.5 we saw reduced downstream calcium related effects (CREB/pCREB) in GlyRα2-KO mice, which was not the case at E16.5. Although this also coincides with our data about the NKCC/KCC protein expression, we can only hypothesize that the absence of the GlyRα2 subunit contributes to a reduction of CREB activation which could contribute to the observed proliferation defects in GlyRα2-KO mice. After partially explaining morphological observed defects in GlyRα2-KO mice striatum (also those observed by Avila et al.) we looked for physiological (Chapter 5) defects in the postnatal striatum (with a deeper focus on the dorsal striatum). We found a GlyR-dependent effect on neonatal spontaneous activity of dorsal striatum medium spiny neurons (MSNs) and maturation of the incoming glutamatergic innervation (interestingly from the cortical layer V which had many deficits as shown by Morelli et al). Our data demonstrate that functional GlyRs are highly expressed in MSNs of one-week-old mice. Spontaneous activity and the frequency of miniature AMPA receptor-mediated currents in MSNs was also reduced in GlyRα2-KO mice. The glutamatergic synapses in MSNs remain functionally underdeveloped in adult GlyRα2-KO mice. This reduction in spontaneous activity and glutamatergic signaling can attribute to the observed changes in neonatal behavioural phenotypes as seen in ultrasonic vocalizations and righting reflex. This deficit is a consequence of impaired development of the neuronal circuitry since acute inhibition of GlyRs by strychnine in adult MSNs does not affect the properties of glutamatergic synapses. These results demonstrate that GlyR-mediated signaling supports neonatal spontaneous MSN activity and, in consequence, promotes the functional maturation of glutamatergic synapses on MSNs. In chapter 6, we focused on the adult dorsal striatum. Here we showed that MSNs express functional GlyRs with the 2-subunit being the main agonist binding subunit. These receptors are extrasynaptic and depolarizing at resting state. The inhibition of GlyRs changes the membrane potential of MSNs and their action potential firing offset. Mice lacking 2 subunits showed impaired motor memory consolidation without any changes in the initial motor performance. Taken together, these results demonstrate that tonically-active GlyRs regulate the firing properties of MSNs and may thus affect the function of basal ganglia. Although we realise this work still leaves questions unanswered, it can be seen as another part of a bigger puzzle in the question how glycine receptors, and as we show, the 2 subunit, is involved in many steps of development ranging from proliferation and synaptic formation in striatal medium spiny neurons.

De ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel start al vroeg in de embryogenese. Het proces van ontwikkeling is zeer complex en vereist een hoge mate van gecoördineerde wisselwerking tussen cellen, genen en externe stimuli. Het is het resultaat van miljoenen jaren van evolutie. Als we naar ons eigen zenuwstelsel kijken, kunnen we zijn complexiteit appreciëren als we denken aan onze zintuigen, cognitieve processen en bewegingen. Het is dan ook des te bewonderingswaardig dat dit alles start als een simpel strookje cellen in het embryo dat de ‘neurale plate’ genoemd wordt. De mechanismen die aan de basis liggen van de uitgroei van deze enkele cellen tot een heel functionerend zenuwstelsel zijn van voorgeprogrammeerde genetische aard en staan onder invloed van externe factoren aanwezig in het extracellulaire milieu. Het doorgronden van deze processen kan de sleutel bevatten om vele neurologische aandoeningen aanwezig in onze samenleving te vermijden of te genezen. In deze scriptie proberen we een klein deel hiervan te belichten, namelijk de invloed van het gen Glra2. Dit gen codeert voor de Glycine receptor alpha 2 subunit en kon al in verband gebracht worden met defecten in de ontwikkeling van bepaalde hersengebieden. De glycine receptor is een ‘ligand gated ion kanaal’ dat permeabel is voor chloride ionen (en ook andere monovalente anionen). De receptor is opgebouwd uit vijf subunits en overspant de plasmamembraan. Het extracellulaire domein is verantwoordelijk voor het binden van een ligand (meest belangrijke zijnde: glycine, taurine, alanine). Na het binden van een ligand vinden er conformationele veranderingen plaats die maken dat de centrale porie van het receptor complex opent voor zijn anionen. De subunits, waaruit de receptor is opgebouwd, kunnen een alpha subunit zijn, of een beta subunit. Indien alle vijf subeenheden uit een alpha subunit bestaan, noemen we de receptor homomeer. Als er een beta subunit bij is, een heteromeer. Er bestaat slechts één beta subunit in tegenstelling tot vier verschillende alpha subunits: 1, 2, 3 en 4 (alpha 4 is niet functioneel bij mensen). De samenstelling van deze eenheden heeft een grote invloed op de functionaliteit van de uiteindelijke glycine receptor. Zo is het dat verschillende types van de glycine receptor op verschillende locaties in het centraal zenuwstelsel voorkomen en dus ook andere functies vervullen. Deze functies, locaties en verschillende eigenschappen hier bespreken/onderzoeken zou nog jaren onderzoek vergen. In dit manuscript bestuderen we het glycine receptor alpha 2 subunit en hoe dit een invloed kan hebben op de ontwikkeling van een type projectie neuronen, genaamd de ‘medium spiny projection neurons’ in de subcorticale structuur genaamd het ‘striatum’. Directe aanleiding voor dit onderzoek is het werk van Avila et al en Morelli et al (uiteraard baseer ik me ook op bevindingen die gemaakt werden door vele anderen). Het werk van Avila et al is zeer relevant voor dit manuscript omdat hier werd aangetoond dat er een directe link is tussen het Glra2 gen en zowel het migreren van interneuronen als ook het prolifereren van projectieneuronen in de cortex, dit in embryologische stadia. Morelli et al, kon aantonen dat er bij muizen waarbij het Glra2 gen werd uitgeschakeld, een onevenwicht ontstaat tussen excitatie en inhibitie in de cortex. Eén van de manieren waarop de glycine receptor zijn embryologische effecten kan veroorzaken, is omdat het in deze ontwikkelingsfase exciterend werkt. In jonge niet-ontwikkelende neuronen is de chlorideconcentratie nog hoog waardoor het openen van de glycine receptor zal leiden tot een uitstroom van chloride zodat de cel depolariseert. Deze depolarisatie kan calcium afhankelijke processen opgang brengen die dan een verdere signaal functie kunnen hebben voor proliferatie, migratie en differentiatie. Wat we in dit werk hebben kunnen vaststellen, is dat de glycine receptor aanwezig is in de embryologische structuur die we de lateral ganglionic eminence (LGE) noemen. Deze aanwezigheid werd aangetoond door immunoreactiviteit en de aanwezigheid van GlyRa2 mRNA bij 13.5 dagen oude muizen embryo’s. Het mRNA van de andere alpha subunits werd niet aangetroffen, enkel dat van het beta subunit. We zouden dus voorzichtig kunnen stellen dat in de LGE, er op embryologische dag (E) 13.5 glycine receptoren zijn die bestaan uit alpha 2 en beta subunits. Dit is belangrijk omdat de LGE de proliferatiekern is voor de MSNs die we verder zullen bestuderen in muizen met en zonder het Glra2 gen. In deze muizen, de GlyRα2-KO muizen, vonden we ook dat er een verminderd aantal MSNs waren op postnatale dag 0 en op volwassen leeftijd. Om dit beter te begrijpen keken we naar het aantal mitotische cellen in de LGE op E13.5 en E16.5. Hier vonden we een reductie van het aantal mitotische cellen op E13.5 in GlyRα2-KO muizen. Echter, op E16.5 zagen we een verhoogd aantal mitotische cellen in de LGE van GlyRα2-KO muizen. Omdat we vermoedden dat (zoals ook bij Avila et al.) calcium afhankelijke mechanisme aan de basis zouden kunnen liggen, werd gekeken naar pCREB op E13.5 en E16.5. Hier zagen we dat, gelijkvallend met een verlaagd aantal mitotische cellen op E13.5 in de GlyRα2-KO muizen LGE, ook minder pCREB proteïne was. Op E16.5 zagen we het omgekeerde, meer pCREB in GlyRα2-KO muizen LGE. Ondanks het feit dat we geen functionele data hebben, keken we verder naar de proteïne- expressie van de chloor co-transporters NKCC1 en KCC2 in micro-gedissecteerd LGE. Ook hier zien we dat het proteïne-expressie profiel van NKCC1 en KCC2 in GlyRα2-KO muizen op E13.5 een minder sterke chloor gradiënt zou kunnen tot stand brengen, waardoor er minder activatie zou kunnen zijn van calcium afhankelijke mechanisme. Op E16.5 zijn alle resultaten omgekeerd. We zouden voorzichtig kunnen stellen dat een verminderde proliferatie op E13.5 in GlyRα2-KO muizen het gevolg is van minder pCREB activatie en dat dit ook niet meer later wordt gecompenseerd. Vervolgens keken we naar de functionele gevolgen van het ontbreken van het Glra2 gen in het dorsale striatum van muizen (hoofdstuk 5). Onze belangrijkste bevinding hier is dat de glutamaterge synaps maturatie verstoord is bij de GlyRα2-KO muizen. Glutamaterge innervatie in het dorsale striatum is afkomstig vanuit de thalamus, of vanuit de corticale laag V (waar Morelli et al. functionele defecten in zag). Samenvallend met deze onderontwikkeling van glutamaterge innervatie op de MSNs, is de verminderde spontane activiteit van MSNs in GlyRα2-KO muizen. We konden ook aantonen dat het enkel het GlyR α2-subunit was dat essentieel was voor het activeren van de GlyRs en dat ze in hoge mate tot expressie komt. Bijkomend zien we ook een fenotype in jonge GlyRα2-KO muizen, zowel een vermindering in het aantal ultrasonic vocalizations en righting reflex. We kunnen ook met grote zekerheid stellen dat de geobserveerde synaptische defecten het gevolg zijn van een ontwikkelingsdeficiet gezien ze niet acuut konden gerepliceerd worden. Als we dus alles samen bekijken, kunnen we stellen dat GlyRs spontane activiteit in MSNs bevorderen en deelnemen aan de correcte maturatie van de glutamaterge synaps op de MSNs. In het laatste hoofdstuk van de resultaten (hoofdstuk 6) focussen we op het volwassen dorsaal striatum. Hier vonden we ook dat de capaciteit van de aanwezige GlyRs om een ligand te binden het gevolg is van het GlyR2-subunit, wat ook zijn belang onderstreept in het volwassen striatum. Een afwijkend fenotype werd ook waargenomen in volwassen GlyRα2-KO muizen. Bij verschillende testen om ‘motor-learning’ te evalueren bleek dat de GlyRα2-KO muizen op een zelfde basis niveau starten met de test als zijn wildtype nestgenoot, maar dat hun vermogen om de test beter uit te voeren na herhaaldelijke sessies sterk verminderd is. Het consolideren van deze ‘motor skills’ blijkt moeilijker te gaan wanneer er geen functionerend Glra2 gen is. Alle data binnen dit hoofdstuk wijzen op een tonische activiteit van de aanwezige glycine receptoren die een 2-subunit bezitten en zo deel uitmaken van een correct functionerend dorsaal striatum. Hoewel er nog hiaten zitten in dit werk, zien we dit toch als een aanvulling binnen de grotere puzzel die er gelegd wordt rond de invloed van GlyRs in neuro-ontwikkeling. Bovendien tonen we op verschillende manieren aan hoe het GlyR2 subunit in vroege ontwikkeling en ook op volwassen leeftijden een belangrijke rol speelt bij het functioneren van neuronen en neuronale structuren.