Targeting the vasculature using extremely low frequency electromagnetic stimulation: a promising therapeutic strategy for ischemic stroke

Abstract

Worldwide, ischemic stroke is classified as one of the leading causes of death and permanent disability in patients. The ischemic insult is mainly caused by a thromboembolic occlusion of a cerebral artery, resulting in a cascade of injurious events ultimately leading to irreversible brain damage. Current therapies mainly focus on restoring blood flow to the salvageable penumbral tissue by recanalization of the occluded vessel. Recanalization can be achieved using thrombectomy or recombinant tissue plasminogen activator (rtPA), of which the latter is the only FDA-approved drug for the treatment of ischemic stroke. Although these therapies are associated with significant improvements in stroke outcome, only a small subset of stroke patients (5-10%) are eligible to receive these treatments due to several contraindications associated with their use in selective patients, their limited availability in ‘general’ clinical centers and their narrow therapeutic time frame. Hence, new effective treatment options are needed that can be applied to a larger population of stroke patients. Following cerebral ischemia, several endogenous repair mechanisms are stimulated, including the recruitment of the leptomeningeal collateral circulation. The ability to recruit these collateral circuits is strongly associated with stroke outcome. Accordingly, improving collateral perfusion towards the tissue “at risk” is considered as a promising therapeutic strategy for ischemic stroke. One of the crucial regulators of cerebral collateral blood flow is the gaseous signaling molecule nitric oxide (NO). Hence, NO-based approaches with the aim to stimulate the collateral circulation following cerebral ischemia have gained increased interest over the last couple of years. In this dissertation, we investigated the potential of extremely low frequency electromagnetic stimulation (ELF-EMS) to increase cerebral collateral perfusion following acute ischemic stroke, based on its capacity to induce NO signaling. Augmenting collateral flow by ELF-EMS seems therefore a promising non-invasive neuroprotective strategy for the treatment of acute ischemic stroke patients. Non-invasive brain stimulation (NIBS) techniques, including ELF-EMS, have been considered as potential (add-on) therapies following ischemic stroke, due to their ability to modify cortical excitability and/or to stimulate neuroprotective/neurorepairative processes in the injured brain. In Chapter II, we reviewed the available literature on clinical studies that assessed the safety and efficacy of different NIBS techniques in ischemic stroke patients. Furthermore, a detailed overview of the activated protective (sub)cellular mechanisms by NIBS was provided. In general, NIBS application was well tolerated and improved overall functional and clinical outcomes of ischemic stroke patients. Although significant progress has been made on identifying the underlying beneficial mechanisms of NIBS to ameliorate post-stroke recovery, future research should focus on establishing a general consensus regarding the optimal stimulation parameters for selected groups of stroke patients in order to successfully implement NIBS approaches in standard stroke care. Several reports have indicated ELF-EMS to mediate its cellular effects by stimulating NO signaling. However, the mechanisms and pathways involved in ELF-EMS-induced NO production remain unidentified. Following ischemic stroke, NO derived from the endothelial nitric oxide synthase (eNOS) isoform has been shown to exert neuroprotective effects, due to its ability to stimulate cerebral collateral perfusion towards the penumbral tissue. Based on this, we postulated in Chapter III that ELF-EMS could reduce ischemic stroke volume by improving cerebral collateral blood flow via activation of the Akt-/eNOS-/NO signaling cascade. We demonstrated that ELF-EMS enhanced NO production by stimulating the Akt-/eNOS-/NO pathway in vitro. Furthermore, activation of this pathway was responsible for ELF-EMS-mediated improvements on vascular perfusion in the hind limb of healthy mice. In accordance to its effects on hind limb perfusion, ELF-EMS augmented cerebral blood flow in both healthy and ischemic mouse brain. To evaluate whether the effects of ELF-EMS on cerebral perfusion resulted in reduced ischemic brain damage due to enhanced collateral recruitment, the therapeutic response of ELF-EMS following experimental stroke was investigated in two different mouse strains with variations in their native cerebral collateral circulation. ELF-EMS application reduced infarct size after ischemic stroke in collateral-rich C57BL/6 mice, but not in collateral-scarce BALB/c mice, suggesting that the protective effects of ELF-EMS following cerebral ischemia are mediated by recruiting the collateral circulation. In Chapter IV, we aimed to identify potential upstream molecular targets which are responsible for enhanced Akt-/eNOS-/NO signaling induced by ELF-EMS in vitro. Previously, it has been shown that ELF-EMS can modulate intracellular signaling cascades by modifying the phosphorylation state of different kinases, by altering intracellular and transmembrane Ca2+-movements and by influencing receptor function. Hence, the possible involvement of multiple signal transduction mediators in ELF-EMS-induced NO signaling was investigated, including β-catenin, Src, G proteins, Ca2+, calmodulin and calcium/calmodulin-dependent kinase II. However, none of the above-mentioned targets contributed to ELF-EMS-induced NO production. Further studies should perform in-depth pathway analyses to determine possible upstream mediators involved in Akt-/eNOS-/NO signaling mediated by ELF-EMS. In conclusion, this dissertation demonstrated the therapeutic potential of ELF-EMS in the treatment of acute ischemic stroke and identified improvements in cerebral collateral blood flow by ELF-EMS as probable protective mechanism. Nevertheless, more insights into the molecular mediators and the optimal treatment protocols of ELF-EMS are required to allow successful translation of ELF-EMS into the clinic.

Wereldwijd wordt ischemisch herseninfarct geclassificeerd als een van de belangrijkste oorzaken van overlijden en blijvende invaliditeit bij patiënten. Het ischemisch letsel wordt hoofdzakelijk veroorzaakt door een trombo-embolische occlusie van een cerebrale slagader, wat resulteert in schadelijke effecten die uiteindelijk leiden tot onomkeerbare hersenschade. De huidige therapieën zijn voornamelijk gericht op het herstellen van de bloedstroom naar het beschadigde hersenweefsel door rekanalisatie van het afgesloten bloedvat. Rekanalisatie kan worden bereikt door trombectomie of recombinant weefselplasminogeenactivator (rtPA), dat het enige door de FDA-goedgekeurde geneesmiddel is voor de behandeling van ischemische herseninfarcten. Hoewel deze therapieën geassocieerd zijn met een aanzienlijke verbetering in het herstel van patiënten na een herseninfarct, komt slechts een kleine groep van patiënten (5-10%) in aanmerking voor deze behandelingen als gevolg van verschillende contraindicaties voor het gebruik ervan bij selectieve patiënten, de beperkte beschikbaarheid ervan in "algemene" klinische centra, en het beperkte therapeutische tijdsvenster waarin deze therapieën kunnen toegediend worden. Daarom is er behoefte aan nieuwe effectieve behandelingsmogelijkheden die toegepast kunnen worden op een grotere populatie van patiënten met een ischemisch herseninfarct. Na cerebrale ischemie worden verschillende endogene herstelmechanismen gestimuleerd, waaronder de rekrutering van de leptomeningeale collaterale circulatie. Het vermogen om deze collaterale circuits te recruteren is sterk geassocieerd met herstel van patiënten na een ischemisch herseninfarct. Bijgevolg wordt het verbeteren van de collaterale perfusie naar het beschadigd hersenweefsel beschouwd als een veelbelovende therapeutische strategie voor ischemische herseninfarcten. Eén van de cruciale regulatoren van de cerebrale collaterale bloeddoorstroming is het signaalmolecule stikstofmonoxide (NO). Vandaar dat NO-gebaseerde therapieën met als doel de collaterale circulatie te stimuleren na cerebrale ischemie de laatste jaren aan belang hebben gewonnen. In dit proefschrift onderzochten we het potentieel van extreem lage frequentie elektromagnetische stimulatie (ELF-EMS) om de cerebrale collaterale perfusie te stimuleren na een acute ischemische herseninfarct, gebaseerd op zijn capaciteit om NO signalering te induceren. Het verhogen van de collaterale bloeddoorstroming door ELF-EMS lijkt daarom een veelbelovende niet-invasieve neuroprotectieve strategie voor de behandeling van patiënten met een acute ischemische herseninfarct. Niet-invasieve hersenstimulatie (NIBS) technieken, waaronder ELF-EMS, worden beschouwd als potentiële (add-on) therapieën na ischemische herseninfarcten, vanwege hun vermogen om corticale exciteerbaarheid te modificeren en/of neuroprotectieve/neuroreparatieve processen te stimuleren in de beschadigde hersenen. In Hoofdstuk II hebben we een overzicht gegeven van de beschikbare literatuur over klinische studies die de veiligheid en effectiviteit van verschillende NIBS technieken bij patiënten met een ischemisch herseninfarct hebben bestudeerd. Verder werd een gedetailleerd overzicht gegeven van de beschermende (sub)cellulaire mechanismen die geactiveerd worden door NIBS. In het algemeen werden NIBS technieken goed verdragen en verbeterde het de functionele en klinische uitkomsten van patiënten met een ischemische herseninfarct. Hoewel aanzienlijke vooruitgang is geboekt bij de identificatie van de onderliggende protectieve mechanismen van NIBS na een ischemisch herseninfarct, moet toekomstig onderzoek zich richten op het bereiken van een algemene consensus over de optimale stimulatieparameters voor geselecteerde groepen van patiënten met een herseninfarct, met het doel om NIBS technieken met succes te implementeren in de standaard behandelingsprotocollen voor ischemische herseninfarcten. Verschillende studies hebben aangetoond dat ELF-EMS zijn cellulaire effecten medieert door het stimuleren van NO signalering. De mechanismen en pathways die betrokken zijn bij ELF-EMS-geïnduceerde NO-productie zijn echter nog niet geïdentificeerd. Na een ischemische herseninfarct is aangetoond dat NO, afkomstig van de endotheliale stikstofoxide synthase (eNOS) isovorm, neuroprotectieve effecten heeft, door zijn vermogen om cerebrale collaterale perfusie te stimuleren naar het beschadigde hersenweefsel. Op basis hiervan veronderstelden we in Hoofdstuk III dat ELF-EMS het ischemische infarctvolume zou kunnen verminderen door de cerebrale collaterale doorbloeding te verbeteren via activering van de Akt-/eNOS-/NO signaalcascade. Wij toonden aan dat ELFEMS de NO productie verhoogde door de Akt-/eNOS-/NO signaalroute in vitro te stimuleren. Bovendien was activering van deze pathway verantwoordelijk voor ELF-EMS-gemedieerde verbeteringen van de vasculaire perfusie in de achterste ledematen van gezonde muizen. In overeenstemming met de geobserveerde effecten op de doorbloeding van de achterste ledematen, verhoogde ELF-EMS de cerebrale doorbloeding in zowel gezonde als ischemische muizenhersenen. Om te evalueren of de effecten van ELF-EMS op cerebrale perfusie resulteerden in verminderde ischemische hersenschade als gevolg van verhoogde collaterale rekrutering, werd de therapeutische respons van ELF-EMS na experimenteel herseninfarct onderzocht in twee verschillende muizenstammen met variaties in hun cerebrale collaterale circulatie. ELF-EMS verminderde de infarctgrootte na ischemische herseninfarct in collateraal-rijke C57BL/6 muizen, maar niet in collateraal-arme BALB/c muizen, wat suggereert dat de beschermende effecten van ELF-EMS na cerebrale ischemie gemedieerd worden door het rekruteren van de collaterale circulatie. In Hoofdstuk IV hebben we getracht potentiële upstream moleculaire doelwitten te identificeren die verantwoordelijk zijn voor de verhoogde Akt-/eNOS-/NO signaaltransductie geïnduceerd door ELF-EMS. Eerder werd aangetoond dat ELFEMS intracellulaire signaalcascades kan moduleren door de fosforylatie status van verschillende kinasen te modificeren, door intracellulaire en transmembrane Ca2+ stromen te moduleren en door receptorfunctie te beïnvloeden. Daarom werd de mogelijke betrokkenheid van meerdere signaaltransductie-mediatoren in ELF-EMS geïnduceerde NO-signalering onderzocht, waaronder β-catenine, Src, G proteïnen, Ca2+, calmoduline en calcium/calmoduline-afhankelijk kinase II. Geen van de bovengenoemde signaalmoleculen droeg echter bij tot ELF-EMS-geïnduceerde NO-productie. Verdere studies zouden diepgaande pathway analyses moeten uitvoeren om mogelijke upstream mediatoren te bepalen die betrokken zijn bij Akt-/eNOS-/NO-signalering gemedieerd door ELF-EMS. Concluderend, dit proefschrift toonde het therapeutisch potentieel aan van ELFEMS bij de behandeling van acute ischemische herseninfarcten en identificeerde verbeteringen in de cerebrale collaterale bloedstroom door ELF-EMS als beschermend mechanisme. Desalniettemin zijn meer inzichten in de moleculaire mediatoren en de optimale behandelingsprotocollen van ELF-EMS nodig om een succesvolle vertaling van ELF-EMS naar de kliniek mogelijk te maken.