Mechanisms of Ionizing radiation resistance in Arthrospira sp. PCC 8005

Abstract

The multicellular cyanobacterium Arthrospira has been studied for many years because of its excellent nutritive value as a food- and feedstock and its many applications in biomedical sciences. The Microbiology Research Unit (MIC) at the Belgian Nuclear Research Center (SCK CEN) studies Arthrospira sp. PCC 8005 that was chosen by the European Space Agency as a principal organism in the MicroEcological Life Support System Alternative (MELiSSA) for efficient O2 production and recycling of CO2, and the production of biomass as a highly nutritional end product. In Chapter 1, we give a general overview on the properties of ionizing radiation (IR) and the effects it can have on living systems. In Chapter 2, we describe the cyanobacterium Arthrospira and highlight important aspects such as oxygenic photosynthesis and the ecology and taxonomy of Arthrospira. Please note that a recent phylogenetic study by Nowicka-Krawczyk and co-workers, 2019 has firmly placed Arthrospira sp. PCC 8005 into the novel genus Limnospira and was renamed as Limnospira indica PCC 8005, now being the species type strain. We included this taxonomic adjustment from Chapter 5 onwards yet for the rest of the thesis, we retained the previous non-allocating name Arthrospira sp. for strain PCC 8005. While investigating the molecular biology of radiation resistance in Arthrospira sp. PCC 8005, we noted variations in Arthrospira trichome geometry and morphology as well as radiation resistance between the new morphotype (designated P2, with linear trichomes and floating behavior) and the original morphotype (designated P6, with helical trichomes and sedimenting behavior). Henceforth, we set out to study the additional differences between the helical form and the new linear form before and after exposure to acute γ-radiation at the RITA facility (in the dark, using a doserate of 600 Gy.h-1) in terms of growth recovery, antioxidant activities, glutathione content, pigment production, trehalose concentration, and transmission electron microscopy ultrastructural analysis (Chapter 3). In addition, we obtained the full genome sequences for the P2 and P6 strains (both of vintage 2018) and performed a comparative sequence analysis between these sequences with the genome sequence of the Arthrospira sp. PCC 8005 parental strain, previously determined and annotated by the MIC group in 2010-2014, as reference (Chapter 3). Comparison of the P2 and P6 genomes revealed a difference of 168 SNPs, 48 indels, and four large insertions affecting 41 coding regions across both genomes with only nine of these regions encoded proteins with a known function. In Chapter 4, we focused on the arh genes as five genes of this locus were previously shown to be highly expressed in response to γ-radiation (up to 60-fold) and so, in an attempt to determine their function and to study their tentative role in radiation resistance, we cloned and heterologously expressed the arhABCDE gene set into E. coli. As a follow-up study of Chapter 3, we also monitored the genetic responses of the P2 and P6 strains when exposed to γ-radiation at similar cumulative doses as before but at a lower doserate and a longer exposure time (i.e., with 3 days exposure in the GEUSE facility applying a lower doserate of 80 Gy.h -1), and with a continuous exposure to light i.e. in fully metabolically active cells (Chapter 5). In this work P6 and P2 cells exposed to the intermediate cumulative dose of chronic γ-radiation (3200 Gy) were analyzed for differential gene expression using RNA-seq transcriptomic analysis for the discovery of genotype-phenotype associations and to verify whether any non-coding RNAs might be at play in Arthrospira radiation resistance mechanisms. From our studies, some interesting observations emerged. With high-dose acute exposure to 60Co γradiation in the dark, both strains P2 and P6 recovered equally well from cumulative doses of up to 2100 Gy. However, whereas P2 fully recovered from the highest cumulative dose of 5000 Gy, the helical strain P6 did not. This was in contrast to chronic exposure to γ-radiation at a much lower dose rate in the presence of light, where both strains eventually recovered from a cumulative dose of 5700 Gy albeit that P6 took about 13 days to regain normal growth while the P2 strain recovered considerably faster i.e., within 6 days. The two strains, highly related to each other yet with distinct phenotypic and genotypic differences, clearly display a strain-specific behavior and genetic response to ionizing radiation-inflicted stress: total antioxidant activity, glutathione content, and pigments showed statistically significant (but minor) dose-specific differences between P2 and P6, while the distinct difference in trehalose content indicated that the P2 strain metabolizes trehalose much faster than the P6 strain, presumably as a dedicated response to cellular radiation damage. Although genetic changes in some genes such as psbD, ycf4, and gvpC were observed, a genotype-phenotype association could not be made solely on the basis of genome sequence. We therefor decided to measure gene expression of γ-ray irradiated versus nonirradiated cells for both strains P2 and P6 and for the first-time used RNA-seq methodology (whereas previously microarray tiling procedures were used) allowing us to cover also genes transcribed into noncoding RNA. In these experiments we choose for a lower doserate in γ-radiation so that the same cumulative doses could be reached as in our previous studies but the exposure to γ-radiation proceeded under light and was prolonged in time to roughly one biomass doubling time (~72 hours). From the chronic exposure gene expression analyzes, it became clear that upon exposure to γ-radiation the P2 strain (straight trichomes, higher IR resistance) pursued cell stability via the enhanced expression of genes involved in cellular protection and protein repair. At the same time, a substantial number of genes were uniquely down regulated in P2 upon exposure to IR, including genes controlling circadian rhythm, dam methylation, and high-intensity light responses. On the other hand, IR-induced genes unique to the P6 strain (helical trichomes, slower post-irradiation recovery) included those involved in cellular protection while IR-repressed P6 genes were indirectly involved in shutting down processes to conserve cellular energy. In addition, some transcriptional regulators and sigma factors as well as some crucial regulatory non-coding RNAs (IsiR, NsiR, Yfr2, SsaA) were found differently expressed in P2 versus P6. Although the two Arthrospira sp. PCC 8005 morphotypes P2 and P6 have 352 differentially expressed genes (DEGs) in common (out of a total of 887 and 666 DEGs for P2 and P6, respectively), pointing to a significant overlapping response to γ-radiation, each substrain seems to follow slightly different routes of priority when it comes down to the use of certain metabolic and regulatory pathways and gene networks.

De meercellige cyanobacterie Arthrospira wordt al vele jaren bestudeerd vanwege zijn uitstekende voedingswaarde en zijn vele toepassingen in de biomedische wetenschappen. De Onderzoekseenheid Microbiologie (MIC) van het Studiecentrum voor Kernenergie (SCK CEN) bestudeert Arthrospira sp. PCC 8005 dat door de Europese Ruimtevaartorganisatie werd gekozen als een van de belangrijkste organismen in het Micro-Ecological Life Support System Alternative (MELiSSA) voor efficiënte O2- productie en het recycleren van CO2, alsook voor de productie van biomassa als een zeer voedingsrijk eindproduct. In hoofdstuk 1 geven we een algemeen overzicht van de eigenschappen van ioniserende straling (IR) en de effecten die het kan hebben op levende systemen. In Hoofdstuk 2 beschrijven we de cyanobacterie Arthrospira en belichten we belangrijke aspecten zoals fotosynthese alsook de ecologie en taxonomie van Arthrospira. Er dient opgemerkt te worden dat een recent fylogenetisch onderzoek door Nowicka-Krawczyk en medewerkers (2019) Arthrospira sp. PCC 8005 in het nieuwe geslacht Limnospira heeft ondergebracht, en momenteel Limnospira indica PCC 8005 wordt genoemd. We hebben deze taxonomische aanpassing vanaf hoofdstuk 5 opgenomen, maar voor de rest van het proefschrift hebben we de eerdere niet-allocerende naam Arthrospira sp. voor stam PCC 8005 gebruikt. Tijdens het onderzoek naar de moleculaire biologie van stralingsresistentie in Arthrospira sp. PCC 8005, merkten we variaties op in de geometrie en morfologie van het Arthrospira-trichoom, evenals een verschil in stralingsweerstand tussen het nieuwe morfotype (aangeduid als P2, met lineaire trichomen en drijvend gedrag) en het oorspronkelijke morfotype (aangeduid als P6, met spiraalvormige trichomen en sedimenterend gedrag). Voortaan gingen we de verschillen tussen de helixvorm en de nieuwe lineaire vorm bestuderen voor en na blootstelling aan acute γ-straling in de RITA-faciliteit (in het donker, met een dosistempo van 600 Gy.h-1). Hierbij werd gekeken naar groeiherstel, antioxidanten, glutathiongehalte, pigmentproductie, trehaloseconcentratie en ultrastructurele analyse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (hoofdstuk 3). Bovendien hebben we de volledige genoomsequenties voor de P2- en P6-stammen (beide van vintage 2018) verkregen en een vergelijkende sequentieanalyse uitgevoerd tussen deze sequenties met de genoomsequentie van de ouderlijke Arthrospira sp. PCC 8005 stam, eerder bepaald en geannoteerd door de MIC-groep in 2010-2014, als referentie (Hoofdstuk 3). Vergelijking van de P2- en P6-genomen leverde een verschil op van 168 SNP's, 48 indels en vier grote inserties die 41 coderende regio's in beide genomen beïnvloeden. Hierbij zijn slechts negen van deze regio’s gekend die coderen voor eiwitten met een bekende functie. In Hoofdstuk 4 hebben we de arhgenen specifiek verder onderzocht, aangezien eerder was aangetoond dat vijf genen van deze locus in hoge mate tot expressie worden gebracht als reactie op γ-straling (tot 60-voudig). In een poging om hun functie en hun rol in stralingsresistentie te bepalen, hebben we het arhABCDE-gen gekloneerd en heteroloog tot expressie gebracht in E. coli. Als vervolgstudie van Hoofdstuk 3 hebben we ook de genetische reacties van de P2- en P6-stammen gevolgd bij blootstelling aan γ-straling bij vergelijkbare cumulatieve doses als voorheen, maar bij een lager dosistempo en een langere blootstellingstijd (dwz met 3 dagen blootstelling in de GEUSE-faciliteit met een lagere dosis van 80 Gy.h-1). Bovendien werden de stammen continu blootgesteld aan licht, dwz volledig metabolisch actieve cellen waren aanwezig (Hoofdstuk 5). In dit werk werden P6- en P2-cellen die waren blootgesteld aan de intermediaire cumulatieve dosis van chronische γ-straling (3200 Gy) geanalyseerd op differentiële genexpressie met behulp van RNA-seq transcriptoomanalyse. Hierbij werd op zoek gegaan naar genotype-fenotype- associaties en werd er nagegaan of niet-coderende RNA's mogelijk een rol spelen in dresistentiemechanismen van Arthrospira tegen straling. Uit onze studies kwamen enkele interessante observaties naar voor. Met een hoge dosis acute blootstelling aan 60Co γ-straling in het donker, herstelden beide stammen P2 en P6 even goed van cumulatieve doses tot 2100 Gy. P2 herstelde echter volledig van de hoogste cumulatieve dosis van 5000 Gy, terwijl de spiraalvormige stam P6 dit niet kon. Dit was in tegenstelling tot chronische blootstelling aan γ-straling met een veel lager dosistempo in de aanwezigheid van licht, waarbij beide stammen uiteindelijk herstelden van een cumulatieve dosis van 5700 Gy, hoewel P6 er ongeveer 13 dagen over deed om weer normaal te groeien terwijl de P2-stam aanzienlijk sneller herstelde, binnen 6 dagen. De twee stammen, sterk aan elkaar verwant maar met duidelijke fenotypische en genotypische verschillen, vertonen duidelijk een stamspecifiek gedrag en genetische respons op ioniserende straling. De totale antioxidantcapaciteit, glutathiongehalte en pigmenten vertoonden statistisch significante (maar kleine) dosisspecifieke verschillen tussen P2 en P6, terwijl het duidelijke verschil in trehalosegehalte aangaf dat de P2-stam trehalose veel sneller metaboliseert dan de P6-stam. Dit is vermoedelijk een specifieke reactie op cellulaire stralingsschade. Hoewel genetische veranderingen in sommige genen zoals psbD, ycf4 en gvpC werden waargenomen, kon een genotype-fenotype-associatie niet alleen worden gemaakt op basis van de genoomsequentie. Daarom hebben we besloten om de genexpressie van beide stammen P2 en P6 al dan niet bestraald met γ-straling te meten met behulp van RNA-seq-methodologie (terwijl voorheen microarray werd gebruikt). Hierdoor konden we ook genen analyseren die zijn getranscribeerd in niet-coderend RNA. In deze experimenten kozen we voor een lagere dosis-straling zodat dezelfde cumulatieve doses konden worden bereikt als in onze eerdere studies, maar de blootstelling aan γstraling verliep onder licht en werd in de tijd verlengd tot ongeveer één biomassaverdubbelingstijd (~ 72 uur). Uit de analyses van de genexpressie met chronische blootstelling werd duidelijk dat de P2-stam (rechte trichomen, hogere IR-resistentie) na blootstelling aan γ-straling celstabiliteit nastreefde via de verhoogde expressie van genen die betrokken zijn bij cellulaire bescherming en eiwitherstel. Tegelijkertijd werd een aanzienlijk aantal genen op unieke wijze downgereguleerd in de P2-stam na blootstelling aan IR, zoals genen betrokken bij het circadiane ritme, de dam methylering en genen betrokken bij responsen op hoge lichtintensiteit. Aan de andere kant konden we inductie van genexpressie, uniek voor de P6-stam (spiraalvormige trichomen, langzamer herstel na bestraling), waarnemen. Deze genen waren betrokken bij cellulaire bescherming, terwijl IR-downgereguleerde P6- genen indirect betrokken waren bij het stoppen van bepaalde processen om cellulaire energie te behouden. Bovendien werden sommige transcriptionele regulatoren en sigma-factoren evenals enkele cruciale regulerende niet-coderende RNA's (IsiR, NsiR, Yfr2, SsaA) anders tot expressie gebracht in P2 versus P6. De twee Arthrospira sp. PCC 8005 morfotypen P2 en P6 hebben 352 differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) gemeenschappelijk (van een totaal van 887 en 666 DEG's voor respectievelijk P2 en P6). Dit wijst op een significante overlap in de respons op γ-straling. Desalniettemin lijkt elke substam enigszins verschillend te prioritiseren wanneer het gaat om het gebruik van bepaalde metabole en regulerende routes en gennetwerken.