The Beneficial Role of Native and Engineered Extracellular Vesicles in Neuroinflammation

Abstract

This dissertation took the first steps in elucidating the therapeutic potential of HSPB8 enriched extracellular vesicles (EVs) upon neuroinflammation. Increasing evidence points towards using extracellular vesicles (EVs) as a therapeutic strategy in neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis, Parkinson’s, and Alzheimer’s disease. EVs are nanosized lipid membrane-enclosed vesicles that could transfer an active molecular cargo from a donor cell toward a recipient cell, playing an important role in cellular communication. The characteristic that EVs could deliver a molecular cargo across natural barriers such as the blood-brain barriers to modulate the recipient cell phenotype makes EVs a promising delivery tool for the treatment of CNS disorders such as neuroinflammatory diseases. Publications demonstrate that intracellular small heat shock proteins (HSPBs) exhibit a beneficial role in neurodegenerative diseases by targeting the autophagy and the apoptosis pathway, playing a prominent role in chaperone activity and cell survival. However, upon secretion of the soluble HSPBs, we argue that the functionality of these HSPBs could be impaired due to the unfavorable inflammatory extracellular environment. Therefore, we propose packaging and protecting HSPB8 within extracellular vesicles as advanced nanocarriers for the future development of neurodegenerative disease therapies. First, the effect of unmodified extracellular vesicles on the regulation and maintenance of cellular homeostasis and how these EVs could influence the phenotype of other microglia subtypes was investigated. Therefore, microgliaderived EVs (M-EVs) were produced in vitro by either Tumor Necrosis Factor-alpha activated or non-activated microglia BV2 cells. This study showed that both mouse and human microglia cells internalize M-EVs and that the uptake of M-EVs in microglia induces autophagy. Additionally, the effect of M-EVs stimulation on either non-activated and activated microglia gene expression profiles was characterized using a targeted inflammation and immunity RNA panel. We provide evidence that microglial EVs can influence multiple biological pathways and promote activation of autophagy to maintain microglia survival and homeostasis. In the following chapter, the contribution of HSPB8 modified oligodendrogliaderived extracellular vesicles (OL-HSPB8-EV) in controlling neuroinflammation and proteostasis is explored. The mechanism by which modified EVs could influence activated microglia to remove cellular debris and cytotoxic proteins by phagocytosis or autophagy to maintain protein homeostasis was investigated. We hypothesized that OL-HSPB8-EVs could modulate cell survival pathways by activating autophagy and reducing reactive oxygen species activities. Therefore, a monoculture system was used to study oligodendroglia-microglia crosstalk, essential for preventing and propagating inflammation in the brain. Results showed that HSPB8-enriched EVs could be internalized by cells and that the uptake increases HSPB8 mRNA and protein levels in the recipient cells, supporting proteostasis and increasing autophagic flux. Moreover, we show the contribution of HSPB8 enriched EVs in supporting chaperoning activity and protection against oxidative stress. Finally, I discuss the implication of our findings to the field of EVs as a therapeutic tool. I critically highlight the most important findings and build further on the advantages and disadvantages of EVs in the clinics.

Deze doctoraatsthesis zette de eerste stappen richting het therapeutisch potentieel van met HSPB8 verrijkte extracellulaire vesikels (EVs) tijdens neuroinflammatie. Toenemend onderzoek wijst op het gebruik van extracellulaire vesikels als therapeutische strategie bij neurodegeneratieve ziekten zoals multiple sclerose, de ziekte van Parkinson en de ziekte van Alzheimer. EVs zijn nanovesikels met een gesloten lipide membraan die een actieve moleculaire lading van een donorcel naar een ontvangende cel kunnen overbrengen, waardoor ze een belangrijke functie uitoefenen in de cellulaire communicatie. Het kenmerk dat EVs een moleculaire lading kunnen transporteren over natuurlijke barrières zoals de bloed-hersenbarrière om daar het fenotype van de ontvangende cel te moduleren, maken van EVs een veelbelovende behandelingsstrategie voor aandoeningen van het centraal zenuwstelsel. Publicaties tonen aan dat intracellulaire kleine ‘heat shock’ proteïnen (HSPB's), waaronder HSPB8, een positief effect uitoefen bij neurodegeneratieve ziekten waarbij deze eiwitten een regulerende functie uitoefenen tijdens autofagie en apoptose. Bijkomend hebben intracellulaire HSPB’s een prominente rol in de chaperonne activiteit en overleving van een cel. Echter blijkt dat bij extracellulaire secretie van vrije HSPB’s in een ongunstig inflammatoire omgeving, de functionaliteit van deze proteinen gereduceerd is. Wij stellen daardoor de hypothese dat het positieve effect van HSPB8 kan worden beschermd door deze proteinen aan te rijken in extracellulaire vesikels als geavanceerde nanodragers voor de ontwikkeling van toekomstige therapieën voor neurodegeneratieve ziekten. Ten eerste wordt het effect van wild-type microglia afgeleide extracellulaire vesikels op de regulatie van cellulaire homeostase en hoe deze EVs het fenotype van andere microglia subtypes kunnen beïnvloeden onderzocht. Microglia EVs (MEVs) werden in vitro geproduceerd door tumornecrosefactor-alfa geactiveerde of niet geactiveerde microglia BV2 cellen. Deze studie toonde aan dat zowel muizen als menselijke microglia cellen M-EVs internaliseren en dat de opname van M-EVs autofagie induceert. Bovendien werd het effect van M-EVs stimulatie op de genexpressie van zowel niet geactiveerde als geactiveerde microglia gekarakteriseerd met behulp van een gericht RNA-panel voor ontsteking en immuniteit. We leverden het bewijs dat microglia EVs meerdere biologische routes kunnen beïnvloeden en de activering van autofagie kunnen bevorderen om de overleving en homeostase van microglia te behouden. In het volgende hoofdstuk werd de bijdrage van gemodificeerde oligodendroglia afgeleide HSPB8 verijkte extracellulaire vesikels (OL-HSPB8-EV) bij het reguleren van neuro-inflammatie en proteostase onderzocht. We onderzochten het mechanisme waarmee gemodificeerde EVs geactiveerde microglia kunnen beïnvloeden om celresten en cytotoxische eiwitten te verwijderen door fagocytose of autofagie om de proteinen homeostase te behouden. We stellen de hypothese dat OL-HSPB8-EVs de overleving van cellen kan moduleren door autofagie te activeren en de activiteiten van reactieve zuurstofcomponenten te verminderen. Hiervoor werd een monocultuursysteem gebruikt om oligodendroglia-microglia communicatie te bestuderen, essentieel voor het voorkomen en verspreiden van ontstekingen in de hersenen. Resultaten toonden aan dat HSPB8 verrijkte EVs door cellen worden geïnternaliseerd en dat de opname de HSPB8-mRNA en eiwitniveaus in de ontvangende cellen verhoogt, wat proteostase ondersteunt en autofagie flux induceert. Bijkomend toonden we aan dat met HSPB8 verrijkte EVs de chaperonne activiteit ondersteund en beschermt tegen oxidatieve stress. Ten slotte bespreek ik de impact van onze resultaten op het gebied van EVs als een therapeutisch hulpmiddel. Ik belicht kritisch de belangrijkste bevindingen en bouw voort op de voor- en nadelen van EVs als therapie.