Targeting the metabolite fingerprint of non-small cell lung cancer: the power of NMR spectroscopy in clinical metabolomics

Abstract

The global cancer burden is still a rapidly growing health problem with high ranked mortality rates. Among all cancer types, lung cancer remains the second commonly diagnosed and the deadliest cancer type by far. High mortality numbers are attributable to lung cancer's typically poor survival rates. Five-year survival rates are highly dependent on the stage of the disease at the time of diagnosis, ranging from 6% for advanced stage to 60% for localized early-stage lung cancer. To improve lung cancer outcomes, minimally-invasive screening tools for detection and monitoring during treatment are crucial. Blood-based biomarkers for early diagnosis, prediction of therapy response, and prognosis, are ideal candidates to aid clinical decision making in the treatment of lung cancer patients. Hereto, the characteristic reprogrammed cancer metabolism can be targeted for biomarker discovery via metabolomics: by analyzing the changing metabolite concentrations, a metabolite fingerprint or a so-called metabolite profile can be determined. This personalized metabolite profile represents the metabolic status of an individual at a certain time point. The first important achievement of this dissertation is the development of a novel methodology for lung cancer detection via human blood plasma using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy as an analytical tool. Based on a metabolite spiking procedure, this quantitative, semi-targeted metabolomics approach allows the simultaneous measurement of 62 plasma metabolites. It is demonstrated how maleic acid can be used as a reliable internal standard for plasma metabolite quantification without the need for protein precipitation. This is realized by avoiding unwanted metabolite binding to human serum albumin (HSA) by adding 4 mM deuterated trimethylsilyl-2,2,3,3-tetradeuteropropionic acid (TSP) that functions as a protein-binding competitor. The second part of this dissertation describes the multicentric clinical trial (NCT03736993) with longitudinal blood sampling design. Hereto, multiple blood samples before and after surgery were collected from early-stage non-small cell lung cancer (NSCLC) patients who all received surgery as treatment. The main study aim represented in this dissertation is the establishment of a biomarker for early detection of disease recurrence after surgery in NSCLC patients. Analysis of the plasma samples from 80 NSCLC patients using the optimized NMR-based methodology led to a scientific breakthrough in this project: for the first time, a significant difference in the patient's metabolic fingerprint before and after complete surgical removal of the lung tumor is demonstrated. In other words, the detection of a metabolic shift in the patient's blood plasma after surgery can provide an indication for a good prognosis, and thus indicates the absence of disease recurrence. The fact that a metabolic "cancer-tohealthy" shift can be measured in blood plasma strongly encourages the belief that the personalized plasma metabolite fingerprint has the potential to serve as a minimal-invasive monitoring tool during follow-up of lung cancer patients with curative intent.

Wereldwijd blijft kanker nog steeds een snel stijgend gezondheidsprobleem met hoge sterftecijfers. Van alle kankertypes is longkanker de tweede meest gestelde diagnose en gaat deze bovendien gepaard met de minst gunstige prognose en dus de grootste kans op kanker-gerelateerd overlijden. Deze hoge sterftecijfers zijn te wijten aan de slechte prognose met lage overlevingskansen die typisch zijn voor een longkanker diagnose. De overlevingskansen zijn echter sterk afhankelijk van het ziektestadium op het moment waarop de diagnose wordt gesteld. Cijfers variëren van slechts 6% vijfjarige overleving voor een gemetastaseerd geavanceerd stadium tot 60% voor een lokale longtumor in een vroegtijdig stadium. Minimaal-invasieve screening tools die vroegtijdige detectie en het monitoren van de patiënt tijdens de behandeling kunnen bevorderen, zijn dus van cruciaal belang om de prognose van longkankerpatiënten te verbeteren. Biomerkers, of meetbare indicatoren, uit bloedplasma kunnen in staat zijn om klinische beslissingen in kader van vroege diagnostiek, voorspelling van herval, en prognose, te ondersteunen. Dergelijke biomerkers kunnen opgespoord worden in het aangepaste kankermetabolisme: het gewijzigde stofwisselingsprofiel van kanker. Gebruik makende van metabolomics technieken kunnen de veranderde concentraties van metabolieten simultaan geanalyseerd worden, en vormen ze samen een metabole vingerafdruk, een zogenaamd metabool profiel. Dit persoonlijk metabool profiel geeft de metabole status van een individu weer op een bepaald specifiek moment. De eerste belangrijke realisatie beschreven in dit proefschrift is de ontwikkeling van een nieuwe methodologie voor longkanker detectie via humaan bloedplasma door gebruik te maken van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie. Deze kwantitatieve, semi-targeted metabolomics techniek is gebaseerd op een spiking procedure waarbij de positie van de signalen van 62 plasma metabolieten exact bepaald wordt. Bovendien laat deze methode toe om deze 62 metabolieten simultaan te analyseren. Er wordt aangetoond dat maleïnezuur kan gebruikt worden als een betrouwbare interne standaard om plasma metabolieten te kwantificeren zonder dat een procedure voor proteïneprecipitatie moet worden uitgevoerd. Dit kan worden gerealiseerd door de binding van plasma metabolieten aan humaan serum albumine (HSA) te vermijden met behulp van de toevoeging van 4 mM TSP dat in competitie treedt met metabolieten voor de binding aan het plasma proteïne. Het tweede deel van dit proefschrift beschrijft de multicentrische klinische studie (NCT03736993) met een longitudinale studie opzet. In het kader van deze studie werden patiënten met een diagnose van vroegtijdige, niet-kleincellige longkanker (NSCLC) geïncludeerd. Al deze patiënten ondergingen een operatie als behandeling waarbij de longtumor volledig verwijderd werd. Alle studiepatiënten doneerden verschillende bloed stalen, zowel voor als na de operatie. Het belangrijkste doel van de studie beschreven in dit proefschrift is het samenstellen van een biomerker die in staat is om NSCLC ziekteherval snel te detecteren via het bloedplasma van de patiënten. Analyse van de pre- en postoperatieve plasmastalen van 80 NSCLC patiënten met de geoptimaliseerde NMR meetmethode heeft geleid tot een wetenschappelijke doorbraak in dit project: voor de eerste keer wordt hier aangetoond dat er een significant verschil is in het metabool profiel van een NSCLC patiënt voor en na de volledige chirurgische verwijdering van de longtumor. Dit betekent dat de detectie van een metabole shift in het bloedplasma van de patiënt na de operatie een indicatie is voor een goede prognose, en dus de afwezigheid van ziekteherval aantoont. Het feit dat een metabole "kanker-versus-gezond" shift kan worden waargenomen in het bloedplasma ondersteunt de hypothese dat het persoonlijk plasma metabool profiel kan dienen als een minimaal-invasief monitoring instrument tijdens de opvolging van de behandeling van longkanker patiënten.