PDE4 gene inhibition - a novel approach to treat demyelinating disorders

Abstract

To allow proper nervous system functioning, glia cells must structurally and metabolically support electrical signal-conducting neurons. However, neurological disorders such as MS, SCI, stroke, and CMT disease severely impact nervous system functioning, leading to prominent disabilities. However, due to the limited regenerative potential of neurons, combined with the destructive microenvironment upon nervous tissue damage, endogenous repair mechanisms are limited in neurological disorders. Furthermore, despite recent progress being made in the development of new treatment strategies, no effective or curative treatment has been approved, capable of improving the patients quality of life. Therefore, the main aim of this dissertation is to evaluate the therapeutic potential of PDE4 subtype and isoform inhibition as a novel and more targeted approach to treat demyelinating and neurodegenerative disorders, while circumventing typical side effects seen upon on full PDE4 inhibition such as diarrhea, nausea and vomiting. In the chronic demyelinating disorder MS, immune cell infiltration and subsequently neuroinflammation leads to focal demyelination and loss of myelinating oligodendrocytes. Once the inflammation is resolved, newly formed oligodendrocytes will regenerate myelin membranes, thereby remyelinating the nude axons. At later stages in the disease, remyelination becomes insufficient and less efficient, leading to prominent and persistent demyelination upon disease progression. Current treatment strategies for MS mainly include antiinflammatory and immunosuppressive drugs. Unfortunately, even though currently available drugs are becoming more effective for treating the initial inflammatory phase of MS, disease progression cannot be halted, nor can repair be induced. As such, there is an urgent need for alternative treatment strategies capable of restoring the remyelination process, thereby inducing repair. Modulating second messenger (cAMP and cGMP) signaling has previously been demonstrated to control both inflammation and CNS repair. Therefore, in chapter 2, an overview is provided regarding the role of PDE inhibition in limiting pathological inflammation and stimulating repair in MS. Subsequently, chapter 3 addresses the therapeutic potential of specifically PDE4B and PDE4D inhibition in different (animal) models of MS. We demonstrated that the full PDE4 inhibitor roflumilast supports neuro-regenerative responses and suppresses neuroinflammation in both the cuprizone and EAE animal model of MS. Importantly, we segregated the myelination-promoting role of PDE4 inhibition into a PDE4D-dependent process, while selective PDE4B inhibition accounted for the anti-inflammatory effects. A major drawback in translating PDE4 inhibitors towards clinical applications are the predicted emetic side effects. Importantly, we demonstrated that the subtype specific inhibitors A33 and Gebr32a used in this dissertation, did not showed preclinical signs of emetic-like behavior as determined via patch-clamp and the in vivo xylazine/ketamine anesthesia test. Nevertheless, since the predicted emetic side effects are ascribed to be related to PDE4D expression in the area postrema in the medulla oblongata, we additionally determined the PDE4D isoform expression profile specifically in neurons of the human area postrema. While short and super-short PDE4D isoforms are hardly expressed in the neurons, these isoforms are highly expressed in human OPCs isolated from human MS lesions. These findings render the (super) short PDE4D isoforms an interesting target to safely enhance remyelination. Since attenuating neuroinflammation and initiating CNS repair are not processes limited and promising for the treatment of only MS, we further explored the therapeutic potential of PDE4 subtype specific inhibitors in other neurodegenerative disorders. Indeed, PDE4 inhibition has already yielded promising results in the context of SCI research due to its broad effects on different injury-related processes including neuroregeneration and immunomodulation. However, as mentioned above, the translation of full PDE4 inhibitors remains limited due to the dose-limiting emetic side effects, leading to poor tolerability in patients. Therefore, in chapter 4, we demonstrated that especially PDE4D inhibition by means of Gebr32a improved functional recovery after SCI. Comparable to the full PDE4 inhibitor roflumilast, Gebr32amediated PDE4D inhibition led to a reduced SCI lesion size, a reduced demyelinated area, decreased neuronal apoptosis, increased 5-HT serotonergic tract regeneration, and enhanced oligodendrocyte differentiation. Furthermore, using in vitro primary mouse neuronal cultures and human iPSC-derived neuronal precursor cell cultures, we demonstrated that the neuroprotective feature of PDE4D subtype inhibition can, at least partially, be attributed to a direct neuronal effect. Finally, using human iPSC-derived neurospheroids, we further demonstrated neuroprotection in a 3D culture model, which was accompanied with increased neuronal differentiation, further supporting the use of the PDE4D inhibitor Gebr32a for the treatment of SCI. Using a proof-of-concept study, the anti-inflammatory potential of PDE4B inhibition was further elucidated in chapter 5 in an animal model of ischemic stroke. By prophylactically administering the PDE4B inhibitor A33, cerebellar infarct size was significantly reduced 24 hours following experimental dMCAO induced ischemic stroke. The reduced lesion size could be attributed to a decreased neuroinflammation as a reduction in infiltrating neutrophils in the ipsilateral hemisphere, and an increase in Arg1+ macrophages throughout the brain was observed. Furthermore, the immunomodulatory properties of PDE4B inhibition were highlighted in vitro since human neutrophil activation was significantly reduced upon PDE4B inhibition as demonstrated in a luminol-based ROS assay. Finally, since demyelinating neurodegenerative disorders are not restricted to the CNS, we further explored the potential of PDE4 subtype inhibition to treat peripheral neuropathies. In the PNS, the myelin-producing glial support is provided by Schwann cells. Besides their myelinating properties, Schwann cells play a crucial role in nerve regeneration following PNS neuropathies as they secrete neurotrophic factors supportive of nerve repair. Interestingly, up to now, the direct effect of pan PDE4 inhibition or PDE4 subtype inhibition on Schwann cells has not been elucidated. In chapter 6, we therefore demonstrated for the first time that PDE4 inhibition, by means of roflumilast, promoted Schwann cell differentiation into a myelinating phenotype in both 2D and 3D culture models. Furthermore, roflumilast-treated Schwann cells promoted axonal outgrowth of human iPSC-derived nociceptive neurons while simultaneously enhancing their myelination capacity, thereby supporting the use of PDE4-inhibitor based treatment strategies for the treatment of peripheral demyelinating neuropathies. Finally, a hereditary peripheral neuropathy animal model for CMT1A disease was used in chapter 7 to evaluate the therapeutic potential of the PDE4D subtype inhibitor Gebr32a to stimulate peripheral remyelination. In line with the myelin regenerative properties observed in CNS pathologies, Gebr32a significantly enhanced sciatic nerve conduction in CMT1A animals, indicating improved myelination. Additional motor functioning phenotyping demonstrated improved motoric coordination, improved sensorimotor functions and increased grip strength upon Gebr32a treatment in CMT1A animals. Finally, post mortem analysis confirmed a remyelination promoting effect of PDE4D inhibition by means of Gebr32a in the sciatic nerve of these animals, indicating the potential of PDE4D inhibition to functionally and molecularly enhance remyelination in the context of CMT1A pathology. Taken together, the development of new and improved remyelinating enhancing and immunomodulatory therapies may prove beneficial for treating a wide range of neurodegenerative and demyelinating disorders including MS, SCI, stroke, peripheral nerve injury and CMT1A. In this dissertation, we provided an incentive for further developing PDE4 subtype specific inhibitors as a novel and clinically relevant drug-based strategy for treating both CNS and PNS related disorders.

Zenuwcellen vertrouwen sterk op gliacellen om structurele en metabole steun te voorzien voor optimale signaaloverdracht. Echter gaan neurologische aandoeningen, zoals multiple sclerose (MS), een ruggenmergletsel, een beroerte en de ziekte van Charcot Marie Tooth (CMT) de werking van het zenuwstelsel sterk beïnvloeden, wat gaat leiden tot prominente beperkingen. De destructieve cellulaire omgeving die voorkomt bij deze neurodegeneratieve ziektes, samen met de niet-regeneratieve eigenschappen van zenuwcellen zelf, gaan het endogeen herstel van het zenuwstelsel beperken. Ondanks de recente vooruitgang bij het ontwikkelen van nieuwe behandelingsstrategieën voor deze neurodegeneratieve ziektes, is er nog steeds geen effectieve of curatieve behandeling beschikbaar die de levenskwaliteit van patiënten kan verbeteren. Het hoofddoel van de huidige dissertatie is dan ook om het therapeutische potentieel van PDE4-subtype- en - isovorminhibitie te evalueren als een nieuwe en gerichte aanpak om demyeliniserende en neurodegeneratieve aandoeningen te behandelen. De infiltratie van immuuncellen, en de daaropvolgende ontstekingsreactie leidt in de chronische ziekte MS tot focale demyelinisatie en het verlies van myeliniserende oligodendrocyten. In de ontstane letsels zullen echter wel nieuw gevormde oligodendrocyten myelinemembranen regenereren, wat vervolgens zal leiden tot een proces genaamd remyelinisatie. Tijdens de progressie van de ziekte zal het remyelinisatieproces echter minder efficiënt en onvoldoende worden, hetgeen zal leiden tot prominente en aanhoudende demyelinisatie. Huidige behandelingsstrategieën voor MS omvatten voornamelijk ontstekingsremmende en immuunonderdrukkende medicijnen. Helaas kunnen zelfs de huidig beschikbare medicijnen de progressie van de ziekte niet afremmen, noch herstel bewerkstelligen. Er is dus een nood aan nieuwe en verbeterde ontstekingsremmende behandelingen die de ontstekingsreactie tijdens vroege stadia van de ziekte verminderen, terwijl regeneratieve therapieën dringend nodig zijn om het remyelinatieproces te herstellen en daarbij herstel te bewerkstelligen. Modulatie van de “second messenger” signalisatiecascades (cAMP en cGMP) werd reeds in het verleden aangetoond om zowel ontstekingsreacties als herstelprocessen in het centrale zenuwstelsel te controleren. Daarom biedt hoofdstuk 2 een overzicht van de rol van PDE-inhibitie bij het beperken van de pathologische ontstekingsreacties en het stimuleren van herstelprocessen bij MS. Vervolgens behandelt hoofdstuk 3 het therapeutische potentieel van specifieke PDE4B- en PDE4D-inhibitie in verschillende diermodellen van MS. Wij hebben kunnen aantonen dat de volledige PDE4-remmer roflumilast zowel neuroregeneratie ondersteunt als ontstekingsreacties onderdrukt in zowel het cuprizone als EAE- diermodel voor MS. Belangrijk is dat we de myeliniserende rol van PDE4-inhibitie hebben kunnen terugleiden tot een PDE4D-afhankelijk proces, terwijl selectieve PDE4B-inhibitie verantwoordelijk was voor de anti-inflammatoire effecten. Een groot nadeel bij het vertalen van PDE4-remmers naar een klinische toepassing zijn echter de voorspelde emetische bijwerkingen (bijvoorbeeld misselijkheid en overgeven). Daarom hebben wij vervolgens via patch-clamp experimenten en de xylazine/ketamine anesthesie test in muizen aangetoond dat de subtypespecifieke PDE4B- en PDE4D-remmers A33 en Gebr32a die gebruikt werden in deze dissertatie geen preklinische tekenen vertonen van emetische bijwerkingen. Aangezien de voorspelde emetische bijwerkingen worden toegeschreven aan PDE4D-expressie in het area postrema in de hersenstam hebben wij bijkomend het PDE4D-isovorm expressieprofiel specifiek in neuronen van het menselijke area postrema bepaald. Terwijl korte en superkorte PDE4Disovormen nauwelijks tot expressie komen in neuronen, zijn deze isovormen zeer aanwezig in humane oligodendrocytprecursorcellen (OPC’s) afkomstig uit MSletsels. Deze bevindingen maken de (super-)korte PDE4D-isovormen een interessant doelwit om remyelinatie veilig te versterken in MS. Aangezien het onderdrukken van ontstekingsreacties in het zenuwstelsel en het initiëren van neuronaal herstel niet enkel kan toegepast worden voor voor de behandeling van MS, hebben wij verder het therapeutisch potentieel van specifieke PDE4-subtyperemmers onderzocht in andere neurodegeneratieve aandoeningen. Vanwege zijn vele beschreven herstelinducerende en ontstekingsremmende eigenschappen, heeft PDE4-inhibitie veelbelovende resultaten opgeleverd in het onderzoek naar ruggenmergletsels. Maar zoals hierboven vermeld, blijft de vertaling van volledige PDE4- remmers naar een klinische toepassing beperkt vanwege zijn dosisafhankelijke emetische bijwerkingen. In hoofdstuk 4 hebben we aangetoond dat vooral PDE4D-inhibitie door middel van Gebr32a functioneel herstel na een ruggenmergletsel verbeterde. Net als de volledige PDE4-remmer roflumilast leidde Gebr32a-gemedieerde PDE4D-inhibitie tot een kleinere letselgrootte, een verminderde gedemyeliniseerde regio, minder apoptotische neuronen, meer regeneratie van 5-HT serotonergische zenuwbundels en een verbeterde oligodendrocytdifferentiatie. Verder hebben wij door middel van primaire muis celculturen en humane iPSCafgeleide neuronale precursorculturen aangetoond dat de neuroprotectieve eigenschappen van PDE4D-subtype-inhibitie ten minste gedeeltelijk toegeschreven kunnen worden aan een direct neuronaal effect. Tenslotte hebben wij met behulp van humane iPSC-afgeleide neurosferen verder kunnen aantonen dat PDE4D-subtype-inhibitie zorgt voor neuroprotectief effect in een 3D-model, wat gepaard gaat met meer neuronale differentiatie, hetgeen verder het gebruik van de PDE4D-specifieke remmer Gebr32a ondersteunt voor de behandeling van een ruggenmergletsel. Met een “proof-of-concept” studie in een diermodel voor ischemische beroerte werd het anti-inflammatoire potentieel van PDE4B-subtype-inhibitie geëvalueerd in hoofdstuk 5. Door de PDE4B-remmer A33 profylactisch toe te dienen, werd de cerebellaire infarctgrootte significant gereduceerd na experimentele dMCAOgeïnduceerde ischemische beroerte. De vermindering in letselgrootte kon worden toegeschreven aan een afname van de ontstekingsreactie, aangezien een afname van de infiltratie van neutrofielen in de ipsilaterale hersenhelft en een toename van M2-fenotype-achtige macrofagen in de hersenen werd waargenomen. Bovendien werden de immunomodulerende eigenschappen van PDE4B-inhibitie verder benadrukt in vitro, aangezien menselijke neutrofielactivatie significant verminderde na PDE4B-inhibitie, zoals aangetoond met een luminol-gebaseerde ROS-test. Tenslotte, aangezien neurodegeneratieve en demyeliniserende ziektes niet enkel voorkomen in het centrale zenuwstelsel, hebben we verder het potentieel van PDE4- en PDE4-subtype-inhibitie onderzocht om perifere neuropathieën te behandelen. In het perifere zenuwstelsel (PZS) bieden de myelineproducerende Schwanncellen gliale ondersteunen aan de zenuwcellen. Maar naast hun myeliniserende eigenschappen spelen Schwanncellen ook een cruciale rol bij zenuwregeneratie bij PZS-neuropathieën door middel van de secretie van neurotrofische factoren. Opvallend is dat, tot nu toe, de directe effecten van PDE4- of PDE4-subtype-inhibitie bij Schwanncellen nog niet werden onderzocht. In hoofdstuk 6 hebben we daarom voor het eerst aangetoond dat PDE4-inhibitie door middel van roflumilast de differentiatie van Schwanncellen tot een myeliniserend fenotype stimuleert in zowel 2D- als 3D-celcultuurmodellen. Bovendien bevorderen roflumilast behandelde Schwanncellen de axonale uitgroei van humane iPSC-afgeleide nociceptieve neuronen terwijl ze simultaan hun myeliniserende capaciteit verhoogden, hetgeen ondersteuning biedt voor het gebruik van PDE4- remmers voor de behandeling van perifere neuropathieën. Vervolgens, in hoofdstuk 7, werd een diermodel voor de erfelijke perifere neuropathie CMT1A gebruikt om het therapeutische potentieel van de PDE4Dsubtyperemmer Gebr32a verder te evalueren. In lijn met de waargenomen myelineregeneratieve eigenschappen in het centrale zenuwstelsel verhoogde Gebr32a de zenuwgeleiding significant in een CMT1A-dieren, hetgeen wijst op een functionele en verbeterde myelinisatie. Verdere karakterisering van motorische functie toonde een verbeterde motorische coördinatie, grijpsterkte en sensorimotorische functies aan. De post mortem analyse bevestigde het remyelinisatiebevorderend effect van PDE4D-inhibitie in de nervus ischiadicus, hetgeen het potentieel van PDE4D-remming aangeeft om functioneel en moleculair herstel te bevorderen in kader van de CMT1A-pathologie. Samengevat kan de ontwikkeling van nieuwe en verbeterde remyelinisatiebevorderende en immunomodulerende therapieën van groot belang zijn voor de behandeling van een breed scala aan neurodegeneratieve en demyeliniserende aandoeningen, waaronder MS, ruggenmergletsel, beroerte, perifere zenuwbeschadiging en CMT1A. In deze dissertatie tonen we dan ook voor het eerst aan dat PDE4-subtypes nieuwe en klinisch relevante doelwitten kunnen zijn voor de verdere ontwikkeling van nieuwe therapieën bij de behandeling van zowel centrale als perifere zenuwstelselaandoeningen.