Targeted detection of nucleic acid mutations for improved lung cancer diagnostics in liquid biopsies

Abstract

De detectie van longkanker-gerelateerde mutaties in minimaal invasieve vloeibare biopsieën, zoals bloedstalen, biedt een groot potentieel voor vroege detectie, gepersonaliseerde therapie en follow-up. De huidige assays op basis van circulerend tumor-DNA hebben echter te kampen met gevoeligheidsproblemen vanwege het lage percentage aan onstabiel tumor-afgeleid DNA in het totale celvrije DNA. Bovendien zijn ze afhankelijk van polymerasekettingreactie (PCR) of next generation sequencing (NGS)-technieken die duur zijn, een hoge doorlooptijd hebben en hoogopgeleid personeel vereisen voor de data-analyse. In dit proefschrift beogen we om de huidige moleculaire diagnostiek voor nietkleincellige longkanker (NSCLC, de meest voorkomende vorm van longkanker) in vloeibare biopsieën te verbeteren volgens twee verschillende aanpakken. Ten eerste hebben we een theoretisch model experimenteel getest om aan te tonen dat selectieve uitputting van wild-type doelwit DNA leidt tot een significante verbetering van de detectiegevoeligheid voor single-nucleotide variant mutaties die in lage frequenties voorkomen. Voor twee klinisch relevante NSCLCmutaties, KRAS G12S en EGFR T790M, werd een verdunningsreeks van synthetische, mutante sequenties in een achtergrond van wild-type fragmenten gemeten op microarrays. Een 7- en 12.5-voudige verbetering in detectielimiet voor KRAS G12S en EGFR T790M, respectievelijk, werd waargenomen in het geval van depletie versus geen depletie. De gevoeligheid was vergelijkbaar met de digitale PCR als standaardmethode voor cel-vrije DNA-analyse. We hebben onze methode geverifieerd met behulp van klinische cel-vrije DNA-stalen van NSCLCpatiënten en waren in staat om een mutatie met zeer lage frequentie te detecteren in het geval van depletie, in overeenstemming met digitale PCR, terwijl deze onder de detectielimiet lag voor het geval van niet-depletie. Aangezien de algemene aanpak toepasbaar is op andere hybridisatie-gebaseerde DNA-biosensor technologieën, hebben we dit deel afgesloten met een haalbaarheidstest om ons concept over te brengen naar een goedkoop sensorplatform op basis van elektrochemische impedantiespectroscopie, dat mogelijk geschikt is voor pointof-care-testen. De functionalisatie van goud-sensorchips werd geoptimaliseerd en sequentie-specifieke hybridisatie werd met succes gemeten. Het tweede doel was om te bestuderen hoe aanrijking van extracellulaire vesikels—kleine cel-afgeleide structuren van nanogrootte—vóór de DNA-analyse kan bijdragen aan een verhoogde gevoeligheid van vroege mutatiedetectie in vloeibare biopsieën. Met behulp van de humane NSCLC-cellijn NCI-H1975 hebben we onderzocht welke nucleïnezuursoorten in kleine EVs (< 200 nm, sEVs) voldoende aanwezig en toegankelijk zijn voor het ontwikkelen van genotyperingsprotocollen, en vonden we dat voornamelijk genomisch DNA (< 35– 100 bp) als template diende voor EGFR T790M mutatiedetectie met digitale PCR en real-time PCR. Vervolgens hebben we met behulp van geoptimaliseerde workflows voor plasmabereiding en sEV-scheidingen, gevolgd door digitale PCRen NGS-detectiemethoden waargenomen dat bij het toepassen van sEV-scheiding voorafgaand aan cel-vrije DNA-extractie op gespiked humaan plasma, significant hogere mutante allelfrequenties werden gevonden in vergelijking met de standaard cel-vrije DNA-extractie. Tenslotte hebben we biolayer interferometry getest voor de analyse van real-time binding van membraan eiwitmerkers die aanwezig zijn op sEVs. Hoewel verdere optimalisatie nodig is om de haalbaarheid van downstream genotyperingsanalyse te beoordelen kon er al na 15–30 minuten een duidelijk concentratie-afhankelijk bindingssignaal worden waargenomen. Hierdoor zou dit een waardevolle point-of-care-methode kunnen zijn voor de detectie van mutante biomerkers op sEVs in vloeibare biopsieën. In conclusie biedt dit proefschrift nieuwe inzichten voor de verbetering van zowel mutatiedetectie in cel-vrije DNA-stalen met behulp van een werkwijze die kan worden overgedragen naar hybridisatie-gebaseerde point-of-care-testen, en van vroege mutatiedetectie met behulp van sEV-scheiding in combinatie met celvrije DNA-extractie.