Carnosine on the move: histidine-containing dipeptides in the pathophysiology and treatment of multiple sclerosis

Abstract

Multiple sclerose (MS) is een ernstige, multifactoriële aandoening van het centrale zenuwstelsel (CZS). De vroege pathologische processen worden aangestuurd door autoreactieve immuuncellen die vanuit de periferie het CZS bereiken. Chronische/aanhoudende ziekteverschijnselen worden daarentegen voornamelijk veroorzaakt door mechanismen in het CZS zelf. Bij neurodegeneratieve aandoeningen zoals MS zijn oxidatieve en carbonyl stress belangrijke bronnen van macromoleculaire schade en functionele achteruitgang. Hoewel de effecten hiervan voortvloeien uit meerdere mechanismen en celtypes, spitst Hoofdstuk 2 zich voornamelijk toe op de kwetsbaarheid van oligodendrocyten, en in het bijzonder oligodendrocyt precursor cellen. Deze cellen spelen een essentiële rol in het CZS omdat ze de isolatielaag (myeline) rond de neuronen aanmaken, en daarmee de communicatie tussen neuronen vergemakkelijken. Ontstekingsgebieden in het CZS van personen met MS en muizen met een MS model (EAE) vertonen overvloedige aanmaak van het reactief carbonyl acrolein (Hoofdstuk 4). Acrolein schade is (op zijn minst deels) afkomstig van ontstekingsactiviteit in microglia en macrofagen, en is aanwezig in allerlei compartimenten en cellen binnen het CZS van MS patiënten. Huidige MS therapieën zijn onsuccesvol in de chronische fase omdat ze de ziekteverschijnselen in het CZS niet weten aan te pakken. Om meer gepaste behandelingen te ontwikkelen, dienen we eerst de exacte ziektemechanismen van MS beter te begrijpen. Hoofstuk 3 introduceert een familie van endogene histidinebevattende dipeptiden (HBD), moleculen met een sterke acrolein bindingsaffiniteit. HBD zijn dus mogelijks betrokken in de ziektemechanismen en behandeling van MS. Via een uitgebreide analyse van de diersoort/mens- en weefselspecifieke distributie van HBD in het lichaam, leerden we dat het enzym carnosine synthase (CARNS1) een uniek mechanisme is om (homo)carnosine te produceren, en bijgevolg een belangrijke determinant is van HBD niveaus in allerlei weefsels doorheen het lichaam. In het CZS vinden we CARNS1 uitzonderlijk in oligodendrocyten (humane witte stof; Hoofdstuk 3 en 5). EAE muizen (Hoofdstuk 4) en muizen met experimentele demyelinisatie (cuprizone model; Hoofdstuk 5) vertonen verlaagde HBD concentraties in het CZS. Dit wordt mogelijks veroorzaakt door de ‘consumptie’ van HBD via acrolein, en door een verminderde CARNS1 expressie ten gevolge van oligodendrocyt schade/dood (wat ook in het CZS van personen met MS kan worden geobserveerd). Muizen die het Carns1 gen missen, en geen HBD kunnen produceren, vertonen een grotere mate van acrolein schade, ontsteking en ziekte symptomen in het EAE model (Hoofdstuk 5). Deze bevindingen wijzen mogelijks op het ontstaan van een vicieuze cirkel, waarbij oxidatieve stress en bijhorende carbonyls schade veroorzaken aan oligodendrocyten, wat daarna leidt tot verminderde CARNS1 en HBD niveaus, en dus een zwakkere bescherming tegen schadelijke carbonyls en gerelateerde ziekteprocessen in MS. Om uit deze cirkel te ontsnappen, test Hoofdstuk 4 het effect van carnosine behandeling bij EAE muizen. De ingenomen carnosine bindt aan acrolein in het CZS, en neutraliseert hiermee overvloedige acrolein schade, ontsteking, en ziekteverschijnselen bij EAE muizen. Celkweek experimenten tonen aan dat carnosine bindt aan acrolein dat geproduceerd wordt door ontstekingsreacties in microglia, en bijgevolg de ontstekingsactiviteit van microglia kan inperken (Hoofdstuk 4). HBD (vooral homocarnosine en carnosine) worden na productie in oligodendrocyten vermoedelijk getransporteerd naar andere CZS cellen (vb. astrocyten, microglia, neuronen). Zulke paracriene effecten blijken ook uit het feit dat cuprizone muizen slechts een matige verlaging in HBD vertonen (Hoofdstuk 5), en dat veel CZS cellen HBD transporters bezitten. Daarbovenop lijken HBD niet essentieel voor de functie van oligodendrocyten zelf, aangezien muizen zonder HBD (en Carns1) normale (re)myelinisatie eigenschappen behouden (Hoofdstuk 5). Carnosine behandeling helpt ook niet om dit te verbeteren in het cuprizone model (Hoofdstuk 5), in tegenstelling tot de effecten van carnosine op ontstekingsmechanismen in het EAE model (Hoofdstuk 4). Deze thesis focust ook op HBD metabolisme doorheen het hele lichaam, met een bijzondere rol voor spierweefsel. Hoofdstuk 3 onthult dat ~99.1% van alle HBD te vinden zijn in skeletspieren, waaronder ook de weinig abundante en voorheen weinig bestudeerde carnosine analogen anserine (in muis, rat), balenine en N-acetylcarnosine (in de mens). N-acetylcarnosine wordt bij mensen continu vrijgezet uit de spier, en het is de meest stabiele (carnosinase-resistente) HBD in plasma. Spieractiviteit (inspanning) verhoogt de afgifte van N-acetylcarnosine, een molecule met vermeende myokine- en hormoon eigenschappen. Carnosine is minder stabiel in plasma bij mensen en wordt voornamelijk in rode bloedcellen getransporteerd (Hoofdstuk 3). EAE muizen vertonen allerlei structurele en functionele afwijkingen in de spier, maar deze zijn onafhankelijk van spier HBD (Hoofdstuk 6). Spiervezels van personen met MS vertonen voornamelijk een verminderde aërobe capaciteit, wat leidt tot een verminderde inspanningscapaciteit (Hoofdstuk 7). Een uithoudings- en kracht programma van 12 w brengt geen verbeteringen teweeg in spierweefsel van personen met MS. De exacte oorzaak van spier metabole afwijkingen, de rol van HBD en (andere) myokines hierin, en de impact ervan op spier-brein communicatie bij MS en andere CZS aandoeningen is onderhevig aan huidig/toekomstig onderzoek. Deze thesis concludeert dat, hoewel veel eigenschappen van hun metabolisme en functie nog onduidelijk blijven, HBD een intrigerende familie van moleculen vormen die een rol spelen in de ziektemechanismen en behandeling van MS, waarbij wordt vermoed dat: 1. CZS ontsteking en demyelinisatie een vicieuze cirkel opwekken waarin overvloedige aanmaak van carbonyls leidt tot oligodendrocyt schade, verminderde CARNS1 en HBD, en bijgevolg een zwakkere bescherming tegen carbonyls door HBD. Carnosine(- gerelateerde) behandelingen zijn veelbelovend voor MS. 2. Een paracriene uitwisseling van HBD vanuit oligodendrocyten naar andere CZS cellen betrokken is bij het functioneren van het CZS en de bescherming tegen CZS ziekten. 3. Een soort van hormonale uitwisseling van (spier) HBD een dynamische regulatie van HBD doorheen het hele lichaam voorziet, en zo een connectie tussen HBDproducerende en HBD-ontvangende organen vormt.

Multiple sclerosis (MS) is a debilitating disease of the central nervous system (CNS) with a multifactorial origin. Whereas the infiltration of peripherally-derived autoreactive immune cells triggers early pathological processes in MS, several CNS-intrinsic mechanisms are the main driving force behind sustained, long-term disease progression. Oxidative and carbonyl stress are potent inducers of the macromolecular and functional deterioration associated with neurodegenerative disorders such as MS. Whilst their effects are widespread, i.e. spanning different cell types and mechanisms, Chapter 2 highlights that oligodendrocytes - and especially oligodendrocyte precursor cells - are highly vulnerable to attack by reactive oxygen or carbonyl species. Oligodendrocytes are crucial to CNS function by enwrapping neurons with myelin, an insulating layer that enhances neuronal communication. In MS and in a preclinical mouse MS model (EAE), the reactive carbonyl acrolein is abundantly generated within inflammatory, demyelinated CNS lesions (Chapter 4). This may be driven by inflammatory activity from microglia and monocyte-derived macrophages, and affects various compartments and cellular structures. Current MS treatments fail to address CNS-intrinsic events and do not prevent chronic disease progression. Deciphering the precise mechanisms that drive disease progression within the CNS will allow for the design of effective therapeutics. Chapter 3 introduces a family of endogenous histidine-containing dipeptides (HCDs), potent acrolein quenchers that may be implicated in the pathophysiology and treatment of MS. An extensive profiling of the species- and tissue-specific distribution and metabolism of HCDs reveals that carnosine synthase (CARNS1) is the unique and rate-limiting enzyme responsible for (homo)carnosine synthesis and scales with tissue HCD content at a whole-body level in mice, rats and humans (Chapter 3). Within the CNS, CARNS1 is enriched in oligodendrocytes (human white matter; Chapters 3 and 5). Intriguingly, endogenous spinal cord HCD levels are reduced in EAE (Chapter 4) and in a mouse model of toxin-induced demyelination (cuprizone; Chapter 5). This may be caused by carnosine ‘consumption’ by acrolein (conjugate formation) and by diminished CARNS1 content resulting from oligodendrocyte loss. The latter is also observed in demyelinated MS lesions. Mice that have a genetic deletion of Carns1, and are devoid of endogenous HCDs, display exaggerated acrolein damage and neuroinflammation during EAE (Chapter 5). Collectively, it is hypothesized that neuroinflammation evokes a vicious cycle in which oxidative stress-induced reactive carbonyls (e.g. acrolein) trigger oligodendrocyte damage/death, resulting in diminished CARNS1 expression, HCD synthesis, and a weakened endogenous protection against carbonyl attack. Aiming to escape from this cycle, the therapeutic potential of carnosine treatment for MS is tested in EAE mice (Chapter 4). This reveals that exogenous carnosine quenches acrolein to form carnosine-propanal in the CNS. Increasing carnosine availability via oral intake suppresses acrolein damage, neuroinflammation, and clinical EAE severity. Moreover, in cultured mouse microglial cells, carnosine quenches inflammation-induced acrolein and dampens their pro-inflammatory phenotype (Chapter 4). Within the CNS, oligodendrocyte-derived HCDs (mostly homocarnosine and carnosine) may be shuttled from their site of production towards other cell types (e.g. astrocyte, microglia, neuron). Such paracrine regulation is supported by the fact that HCD levels do not dramatically drop in the CNS of mice exposed to cuprizone (Chapter 5) and by the expression of HCD transporters on various CNS cells. In fact, HCDs (and CARNS1) do not seem essential for normal oligodendrocyte development and function, as Carns1-deficient mice maintain normal (re)myelination capacity (Chapter 5). In keeping with this, exogenous carnosine does not directly impact de- or remyelination dynamics within the CNS (cuprizone model; Chapter 5), as opposed to the profound effects on neuroinflammation (EAE model; Chapter 4). This dissertation also focuses on whole-body HCD dynamics, with a central role for skeletal muscle tissue. Chapter 3 estimates that skeletal muscle tissue harbors 99.1% of the total body HCD pool, including the greatest levels of the carnosine analogs anserine (in rodents), balenine and N-acetylcarnosine (in humans). Interestingly, Nacetylcarnosine is continuously secreted from muscle tissue and is the most stable (carnosinase-resistant) HCD in human plasma. Muscle activity (exercise) further induces N-acetylcarnosine release from muscle tissue in a myokine-like, endocrine fashion. The less stable plasma HCD carnosine is preferentially transported within red blood cells in humans (Chapter 3). Although EAE mice display deteriorated muscle structure and function, this is not caused by altered muscle HCD levels (Chapter 6). Similarly, muscle biopsy studies reveal significant alterations in skeletal muscle tissue from people with MS, most strikingly a reduction in muscle fiber oxidative capacity that constrains whole-body exercise tolerance (Chapter 7). Muscular impairments do not respond to a 12-week exercise intervention in MS, further supporting muscle anomalies in MS. The precise nature of muscle metabolic dysfunction, its link with HCDs and (other) myokines, and its impact on muscle-brain crosstalk in MS and other neuroinflammatory or neurodegenerative disorders, are topics of ongoing and future research. In conclusion, although many aspects of their regulation and function remain enigmatic, the present dissertation identifies the HCD family as intriguing new players in the pathophysiology and treatment of MS, proposing that: 1. Neuroinflammation and demyelination induce a vicious cycle of carbonyl stress, oligodendrocyte damage/death, diminished CARNS1 expression, and weakened endogenous protection from HCDs against carbonyl attack. Carnosine(-based) treatment holds therapeutic promise for MS. 2. Paracrine shuttling of (homo)carnosine from oligodendrocytes towards other cells mediates/protects CNS function during health/disease. 3. Whole-body HCD dynamics involve endocrine exchange of (muscle-derived) HCDs between tissues with diverse HCD synthesis and transport capacities.