The interaction of calcium and uranium during uranium stress in Arabidopsis thaliana: uptake, distribution and stress responses

Abstract

Uranium (U) is a naturally occurring heavy metal, yet anthropogenic sources of U are omnipresent. Uranium mining, milling and the use of phosphate fertilizers contaminate many areas and ecosystems. Plants in these ecosystems exposed to U can encounter toxic effects. As such, U disturbs the nutrient balance, inhibits plants growth and induces oxidative stress. Uranium uptake and toxicity are largely dependent on its speciation. Uranium speciation can be influenced by environmental factors such as the pH of the nutrient solution and the presence of other elements for example calcium (Ca) in the nutrient solution. Previous research has suggested that Ca influences U uptake, while another study found that additional Ca in the nutrient medium alters U toxicity. However, further knowledge is needed to get an in-depth understanding of the influence of the interaction between Ca and U on both U uptake and toxicity. In this work, we integrated the effects of the external as well as the internal Ca levels on U uptake, distribution and toxicity in Arabidopsis thaliana. First, we assessed the effects of external Ca levels on U uptake, distribution and toxicity in A. thaliana (Chapter 3). For this purpose, plants were grown in nutrient solutions with a low (30 µM), normal (300 µM) or high (3 mM) Ca concentration and then exposed to U (50 µM) for 24 or 72 h. The results showed a clear distinction in U response between roots and shoots. Whilst low Ca partially alleviated growth inhibition induced by U in roots, it did not influence oxidative stress levels or U uptake. A stronger growth inhibition was observed in U-exposed roots grown on medium with a high Ca concentration. On the contrary, in shoots, a low Ca concentration in the nutrient medium decreased the Ca shoot concentration, as well as the oxidative stress levels and growth inhibition after U exposure. The opposite was seen in U-exposed shoots supplied with a high Ca concentration in the nutrient solution. Since a relatively low amount of U (about 0.01%) reaches the shoots, the influence of Ca on the U-affected parameters (oxidative stress hallmark gene expression and shoot growth) in the shoots suggested that Ca signalling might be important in the U response in this organ. Furthermore, U exposure decreased the gene expression of CATION/PROTON EXCHANGER (CAX) 1 in shoots and increased CAX3 and CAX4 expression in roots. Therefore, in a next experiment, mutant plants deficient in one or more of these CAX transporters were exposed to U (25 or 50 µM) for 24 or 72 h. Again, a clear difference in involvement of the CAX transporters in roots versus shoots was observed. In roots (Chapter 4), it was suggested that CAX4 might play a role in regulating U transport in the root tissue towards the stele, without an influence of CAX1 or CAX4 on U toxicity. In contrast, in shoots (Chapter 5), CAX1 seemed to stimulate oxidative signalling, whereas a lower CAX4 expression resulted in higher shoot potassium levels. The results suggested that CAX transporters play a role in U responses in shoots, each in a different way. To get a broader insight in the response of plants to U, the proteome (mass spectrometry) and transcriptome (RNA sequencing) of shoots exposed to U (25 µM, 72 h) were compared to those of control shoots (0 µM U). These results showed that in U-exposed shoots, besides oxidative stress levels, the antioxidative defence is also stimulated. Furthermore, the jasmonic acid (JA) biosynthesis enzymes were upregulated, supporting the previously suggested role for JA, a well-known stress-induced phytohormone in root-to-shoot signalling during U exposure. Several up- and downregulated processes also implied potential involvement of the target of rapamycin complex 1 (TORC1) in the growth inhibition that is observed during U exposure. In conclusion, the results show the interplay of Ca (external and internal) and U in terms of U uptake, distribution and toxicity in A. thaliana and that this interaction manifests very differently in roots versus shoots. Furthermore, TORC1 might be involved in regulating the growth inhibition instigated by U. Also, signalling during U exposure involves Ca signalling (and potentially JA). The results of this work can contribute to a better understanding of the involvement of Ca and U in the responses of plants to U and aid in improving ways to clean up and/or safely utilize U-contaminated soils for example for the production of biofuel.

Uranium (U) is een natuurlijk voorkomend zwaar metaal, hoewel antropogene bronnen van U alomtegenwoordig zijn. Het winnen en zuiveren van U en het gebruik van fosfaatkunstmeststoffen vervuilen vele gebieden. Planten in deze gebieden nemen U op en worden blootgesteld aan de toxische effecten ervan. Uranium verstoort de nutriëntenbalans, inhibeert plantengroei en induceert oxidatieve stress. De opname en toxiciteit van U zijn grotendeels afhankelijk van de speciatie, die beïnvloed kan worden door omgevingsfactoren zoals de pH van de voedingsoplossing en de aanwezigheid van bijvoorbeeld calcium (Ca) in de voedingsoplossing. Voorgaande onderzoeken hebben vastgesteld dat Ca U opname beïnvloedt, terwijl in een andere studie werd vastgesteld dat een toevoeging van Ca aan het voedingsmedium U toxiciteit verandert. Er is echter meer kennis nodig om de invloed van de interactie tussen Ca en U op zowel U opname als toxiciteit beter te begrijpen. In dit werk integreerden we de effecten van de externe en interne Ca niveaus op U opname, distributie en toxiciteit in Arabidopsis thaliana. Eerst hebben we gekeken naar de effecten van externe Ca niveaus op U opname, distributie en toxiciteit in A. thaliana (Hoofdstuk 3). Voor dit doeleinde werden planten opgegroeid in voedingsoplossingen met een lage (30 µM), normale (300 µM) en hoge (3 mM) Ca concentratie en vervolgens blootgesteld aan U (50 µM) gedurende 24 of 72 u. De resultaten toonden een duidelijk onderscheid in U respons tussen wortels en blaadjes. Terwijl lage Ca concentraties de groeiinhibitie geïnduceerd door U deels verlichtten in de wortels, beïnvloedden deze de oxidatieve stress niveaus of U opname niet. In medium met een hoge Ca concentratie daarentegen, werd een sterkere groei-inhibitie geobserveerd in wortels blootgesteld aan U. Aan de andere kant, deed een lage Ca concentratie in het voedingsmedium de Ca concentratie afnemen in de blaadjes van planten blootgesteld aan U; hetzelfde gold ook voor de inductie van oxidatieve stress niveaus en de inhibitie van de groei. Het omgekeerde werd geobserveerd in blaadjes van planten blootgesteld aan U en gegroeid in een voedingsoplossing met een hoge Ca concentratie. Aangezien er slechts een kleine hoeveelheid U (ongeveer 0.01%) de blaadjes bereikt, suggereerde de invloed van Ca op de parameters beïnvloed door U (expressie van oxidatieve stress hallmark genen en groei van de blaadjes) dat Ca signaaltransductie belangrijk zou kunnen zijn in de U respons in dit orgaan. Verder deed U de genexpressie van CATION/PROTON EXCHANGER (CAX) 1 afnemen in blaadjes en de expressie van CAX3 en CAX4 toenemen in wortels. Daarom werden in een volgend experiment mutanten, deficiënt in één of meerdere van deze CAX transporters, blootgesteld aan U (25 of 50 µM) gedurende 24 of 72 u. Een duidelijk verschil in de betrokkenheid van de CAX transporters in wortels versus blaadjes werd opgemerkt. In wortels (Hoofdstuk 4) werd een rol voor CAX4 naar voren geschoven in het reguleren van het U transport in het wortelweefsel richting de centrale cilinder, zonder een invloed van CAX1 of CAX4 op U toxiciteit. In de blaadjes (Hoofdstuk 5) leek CAX1 oxidatieve signaaltransductie te stimuleren, terwijl een lagere CAX4 expressie resulteerde in hogere kaliumniveaus in de blaadjes. Deze resultaten suggereerden dat CAX transporters een rol spelen in U responsen in de blaadjes, elk op een andere manier. Om een breder inzicht te verwerven in de responsen van planten op U werd het proteoom (massaspectrometrie) en transcriptoom (RNA sequenering) van de blaadjes van planten blootgesteld aan U (25 µM, 72 u) vergeleken met die van de controle planten (0 µM). Deze resultaten toonden dat in blaadjes van aan U blootgestelde planten, naast oxidatieve stress niveaus, de antioxidatieve verdediging ook gestimuleerd werd. Verder waren ook de enzymen voor de biosynthese van jasmonaat (JA) opgereguleerd, wat de rol van JA in wortel-naarblad (root-to-shoot) signaaltransductie tijdens U blootstelling, gesuggereerd door voorgaand onderzoek, ondersteunt. Verschillende up- en downgereguleerde processen wezen ook op een mogelijke betrokkenheid van het target of rapamycin complex 1 (TORC1) in de groei-inhibitie die wordt gezien tijdens U blootstelling. Samengevat tonen de resultaten de interactie van (interne en externe) Ca en U concentraties wanneer we U opname, distributie en toxiciteit in A. thaliana beschouwen en dat deze interactie zich op een heel andere manier manifesteert in wortels dan in blaadjes. Bovendien is TORC1 mogelijks betrokken bij het reguleren van de groei-inhibitie die door U wordt aangezet. Ook is Ca-gemedieerde signaaltransductie (en mogelijks ook JA) betrokken bij de signaaltransductie tijdens U blootstelling. De resultaten van dit werk kunnen bijdragen aan een beter begrip van de betrokkenheid van Ca en U in de responsen van planten op U en kunnen helpen om het saneren van met U gecontamineerde bodems en/of veilig inzetten van deze bodems voor de productie van bijvoorbeeld biobrandstoffen.