Nanobodies for the early detection of cancer: a case study on ovarian cancer

Abstract

Eierstokkanker (OC) staat op de vijfde plaats van sterfgevallen door kanker bij vrouwen (na longkanker, borstkanker, darm- en rectumkanker en pancreaskanker) en is moeilijk tijdig te diagnosticeren vanwege de aspecifieke symptomen. De meeste vrouwen worden hierdoor pas in een gevorderd stadium van de ziekte gediagnosticeerd, wat resulteert in een relatief vijfjarig overlevingspercentage van ongeveer 47%. Dit staat in sterk contrast met het overlevingspercentage van maar liefst 94% wanneer de ziekte in een vroeg stadium wordt ontdekt en behandeld. Er is dan ook een duidelijke behoefte aan betere screeningmethoden waarmee OC in een vroeg stadium kan worden opgespoord. Biosensoren zijn een veelbelovende manier om specifieke biomarkers in complexe monsters op een gevoelige en selectieve manier te detecteren. Binnen deze context hebben nanobodies (Nbs) een aantal voordelen ten opzichte van conventionele antilichamen, zoals hun kleine dimensies die een dichte bedekking van biosensoroppervlakken toelaten; hun eenvoudige productie en hun inherente stabiliteit wat betreft pH en temperatuur. Bovendien kunnen nanobodies gemakkelijk worden aangepast met liganden om op een georiënteerde manier aan biosensoroppervlakken gekoppeld te worden. Nanobodies hebben dus het potentieel om de weg vrij te maken naar efficiëntere biosensoren voor screeningdoeleinden en therapieopvolging. Voor OC wordt hierbij gedacht aan multiarray-sensoren die tegelijkertijd de biomarkers CA125, HE4, SLPI en PGRN monitoren. Door de gelijktijdige detectie van meerdere biomarkers, kan de gevoeligheid en specificiteit van nanobodygebaseerde sensoren worden verhoogd, waardoor meer patiënten in een vroeg stadium kunnen worden opgepikt. Dit proefschrift is gericht op het ontwerpen en ontwikkelen van gemodificeerde nanobodies om de gevoeligheid en selectiviteit van biosensoren voor de detectie van vroege en relevante OC-biomarkers te verbeteren. Voor dit doel werden Nbs gericht tegen biomarker antigenen van eierstokkanker (HE4, SLPI en PGRN) i) geselecteerd en gekarakteriseerd, ii) gemodificeerd aan de C-terminale zijde met behulp van de EPL- of SPL-techniek, en iii) geëvalueerd betreffende de detectiegrens in een sandwich ELISA test (enzymgekoppelde immunoassay). Voor de selectie en karakterisering kunnen Nbs gericht tegen OC-biomarkers (HE4, SLPI en PGRN) met succes tot expressie worden gebracht in het periplasma van E. coli WK6 en gezuiverd worden via IMAC- en SECchromatografie. De verkregen Nbs-expressieniveaus lagen tussen 0.1 en 25.2 mg/L. De antigeenbindingsaffiniteit en concurrerende eigenschappen werden met succes bereikt door middel van ELISA, SPR en epitoopmapping. Veelbelovende Nb kandidaten voor het ontwikkelen van diagnostische tests om de HE4, SLPI, en PGRN serum antigeen concentraties te monitoren werden gedefinieerd als deze met een lage KD < 50 nM, een lage koff < 75.10-3 s-1, een hoge kon van ongeveer 106 M-1s-1, een expressie opbrengst > 0.25 mg/L, en het vermogen om een niet-competitief Nb-paar te vormen voor het bewuste antigeen (HE4, SLPI of PGRN). Nanobodies met hoge bindingsaffiniteit en expressieopbrengst werden gekozen voor verder onderzoek. Daarnaast werden de niet-competitieve Nb-paren bepaald. Deze paren kunnen worden gebruikt voor het vangen en detecteren van de kankerantigenen in de uiteindelijke op sandwich-ELISA gebaseerde testen. De detecterende Nbs zullen hierbij worden geconjugeerd met biotine om te kunnen binden aan het HRP-geconjugeerde streptavidine-enzym dat wordt gebruikt om de antigeenconcentratie te bepalen. De zeven meest belovende Nb-klonen voor de ontwikkeling van een test voor eierstokkanker waren: HE4-1 en HE4-6; SLPI-1 en SLPI-7; PGRN-5, PGRN-7 en PGRN-11. Aangezien het expressierendement klein was, moest het expressierendement van de Nbs SLPI-7 en PGRN-7 verder worden geoptimaliseerd. Kortom, de Nbs gericht tegen biomarkers van eierstokkanker werden geïdentificeerd, gekarakteriseerd en de veelbelovende Nbs werden geselecteerd voor verdere conjugatie met biotine aan de C-terminus. Voor de plaats-specifieke modificatie van de Nbs, werden aan de C-terminus met succes een alkyn of azide functie aangebracht via de expressed protein ligation methode (EPL), waardoor de gemodificeerde Nbs geconjugeerd kunnen worden aan verschillende azide/alkyne-bevattende biotinelinkers via de kopergekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). De alkynatie/azidificatie van Nbs werd bevestigd via SDS-PAGE en western blot na conjugatie met PEG-N3 (10 kDa) of een biotinelinker. De opbrengst aan gefunctionaliseerde Nbs bleek echter onvoldoende voor ons doel, zodat de op sortase A gebaseerde eiwitconjugatiemethode (SPL) werd gebruikt als alternatief. SPL is een breder toepasbare methode en werd gebruikt om LPETGG-bevattende nanobodies te voorzien van een biotinelabel ter hoogte van de C-terminus. De efficiëntie van de biotinylering van Nbs gekatalyseerd door Sortase A (SrtA) werd onderzocht en de gebiotinyleerde Nbs werden met succes bekomen met een hoge opbrengst in vergelijking met de EPL-methode. Hierdoor konden de Nbs gebruikt worden voor de bepaling van de detectielimiet (LOD) voor de verschillende biomerker antigenen van belang (HE4, SLPI en PGRN). De optimale experimentele omstandigheden voor de biotinylering van Nbs met GGGK-biotine werden bepaald en kunnen als volgt worden samengevat: 15 µM Sortase A, 10 µM NbLPETGG-His6, 200 µM GGGK-biotine, bij 37 ºC en 24 uur incubatietijd. Toekomstige mogelijkheden omvatten een verdere optimalisering van de SPLgemedieerde koppelingsprocedure en de conjugatie van de nanobodies met labels voor MRI en fluorescerende kleurstoffen zoals oligoglycine-5-FAM en NIR IRDye800CW, om de weg te effenen naar een generieke methode voor de productie van plaatsgebonden contrastgelabelde nanobodies voor geavanceerde toepassingen in de medische diagnostiek. In het algemeen presteert de SPLbenadering beter dan de EPL wat betreft de opbrengst. Om de LOD (limiet van detectie) te bepalen voor de antigenen werden nietcompetitieve paren gebruikt als capterende en detecterende Nbs in een sandwich-ELISA. De detecterende Nbs waren gebiotinyleerd. De uitstekende LOD-waarden die voor alle drie de antigenen in humaan serum werden verkregen, duiden op een zeer specifieke en gevoelige binding van de antigenen aan de geselecteerde Nbs. De LOD-waarden in humaan serum voor HE4, SLPI en PGRN bedroegen respectievelijk 37, 163 en 195 pM. Deze LOD-waarden zijn lager (of van dezelfde orde van grootte) dan de antigeenconcentraties gemeten in het serum van gezonde vrouwen, namelijk 38.2, 2462 en 491 pM voor respectievelijk HE4, SLPI en PGRN. Dit betekent dat de geselecteerde nanobodies uitstekende kandidaten kunnen zijn voor de vroege diagnose van OC via de ontwikkeling van multiarray biosensoren waarin meerdere relevante biomarker-antigenen tegelijkertijd worden gedetecteerd. Toekomstig onderzoek zal moeten uitwijzen of een diagnostische test die steunt op de voorgestelde nanobodies inderdaad in staat is om een onderscheid te maken tussen OCpatiënten en gezonde vrouwen.

Ovarian cancer (OC) ranks fifth in cancer-related deaths among women (after lung cancer, breast cancer, colon & rectum, and pancreas cancer) and is difficult to diagnose in a timely manner due to its nonspecific symptoms, resulting in high mortality. Most women are therefore diagnosed only at an advanced stage of the disease, resulting in a 5-year relative survival rate of around 47% which is in strong contrast to a survival rate as high as 94% if detected and treated at an early stage. As a result, there’s a clear need for improved screening methods that enable the early detection of OC. Biosensors offer a promising way to detect specific biomarkers in complex samples in a sensitive and selective way. Because nanobodies (Nbs) have numerous benefits over conventional antibodies, including their small size which enables the dense coverage of biosensor surfaces, their ease of production, and their inherent stability in terms of pH and temperature, they are very promising species to detect the antigen in biosensors. Moreover, nanobodies can be easily engineered to allow their oriented coupling to biosensor surfaces. As such, nanobodies can pave the way towards more efficient biosensors for screening purposes and therapy follow-up, especially multiarray sensors that simultaneously monitor the CA125, HE4, SLPI, and PGRN biomarkers. By enabling the simultaneous detection of multiple biomarkers, the sensitivity and specificity of nanobody-based sensing formats can be increased. As a result early stage patients can be distinguished from healthy controls. This PhD thesis aims to design and develop modified nanobodies to improve the sensitivity and selectivity of biosensors for the detection of early and relevant OC biomarkers. For this purpose, Nbs targeting ovarian cancer biomarkers (HE4, SLPI, and PGRN) were: i) selected and characterized, ii) modified at the C-terminus using either the EPL or SPL technique, and iii) applied to determine the limit of antigen detection in a sandwich ELISA format (enzyme-linked immuno sorbent assay). For the selection and characterization, Nbs targeting OC biomarkers (HE4, SLPI and PGRN) were successfully expressed in the periplasm of E. coli WK6 cells and purified via IMAC and SEC chromatography. Nbs expression levels obtained were situated between 0.1 and 25.2 mg/L. The antigen binding affinity and competitive properties were successfully achieved by means of ELISA, SPR and epitope mapping. Promising Nb candidates for developing diagnostic tests to monitor the HE4, SLPI, and PGRN serum antigen concentrations were defined as those having a low KD < 50 nM, a low koff < 75.10−3 s−1, a high kon of around 106 M−1s−1, an expression yield > 0.25 mg/L, and the ability to form a noncompetitive Nb pair for the antigen of interest (HE4, SLPI or PGRN). Nanobodies with high binding affinity and expression yield were chosen for further research in order to improve the sensitivity and selectivity of biosensors for early disease detection. The non-competitive Nb pairs were also determined. These pairs can be used for capturing and detecting the cancer antigens in the final sandwichELISA-based tests of which the limit of detection (LOD) values were determined. The detecting Nbs were hereto conjugated with biotin in order to be able to bind to the HRP-conjugated streptavidin enzyme used to determine the antigen concentration. The seven most promising Nb clones for the development of an ovarian cancer test were: HE4-1 and HE4-6; SLPI-1 and SLPI-7; PGRN-5, PGRN7 and PGRN-11. Since the expression yield for Nbs SLPI-7 and PGRN-7 is small, an optimization of the expression yield of the was needed. In conclusion, the Nbs targeting ovarian cancer biomarkers were identified, characterized and the promising Nbs were selected for C-terminal biotinylation. Regarding the site-specific modification of the Nbs at their C-terminus, Nbs were initially successfully alkynated or azidified by EPL (expressed protein ligation) and conjugated to various azide/alkyne-containing biotin linkers via the coppercatalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC). To produce Nb-biotin, Nbs were alkynated using EPL and conjugated to an azide-PEG3-biotin linker. The alkynated Nbs were additionally conjugated to PEG-N3 polymer with a molecular weight of 10 kDa. In addition, Nbs were also azidified using EPL and conjugated with alkyne-PEG4-biotin linker. The alkynation/azidification of Nbs was confirmed by SDS-PAGE and western blot. However, the yield of the functionalized Nbs was not high enough to study if the sensitivity and selectivity of the antigen binding was high enough for a diagnostic sandwich ELISA OC test. Therefore, the SPL method was evaluated as an alternative. SPL, a more generic approach was used to label LPETGG-containing nanobodies with a biotin molecule at their C-terminus. The efficiency of the SrtA catalyzed biotinylation of Nbs was investigated and demonstrated to be efficient. In contrast to the EPL method, biotinylated Nbs were successfully synthesized with high yield with the SPL method, allowing to use the biotinylated Nbs for the determination of the LOD for ovarian cancer detection via the biomarkers of interest HE4, SLPI and PGRN. The optimal experimental conditions for the biotinylation of Nbs with GGGKbiotin was determined, and can be summarized as: 15 µM Sortase A, 10 µM NbLPETGG-His6, 200 µM GGGK-biotin, at 37 ºC and 24 hours incubation time. Prospective work includes a further optimization of the SPL-mediated coupling procedure as well as conjugating nanobodies to labels for MRI and fluorescent dyes such as oligoglycin-5-FAM and NIR IRDye800CW in order to pave the way towards a generic method to produce site-specifically contrast-labelled nanobodies for advanced applications in medical diagnostics. In general, the SPL approach outperforms EPL in terms of yield of functionalized Nbs. For the determination of the LOD, non-competitive pairs were used as capturing and detecting Nbs in a sandwich ELISA. The detecting Nbs were biotinylated. The excellent LOD values obtained for all three antigens in human serum indicated the highly specific and sensitive binding of the antigens to the selected Nbs. The LOD values obtained in human serum for HE4, SLPI, and PGRN were 37, 163, and 195 pM, respectively. The LOD values were lower (or of the same order of magnitude) than the concentration of these antigens in the serum of healthy women, i.e., 38.2, 2462, and 491 pM for HE4, SLPI, and PGRN, respectively. This implies that the selected nanobodies are excellent candidates for the early diagnosis of EOC as well as for the development of multiarray biosensors in which multiple relevant biomarker antigens are detected simultaneously in a highly sensitive and selective manner. Future work will be needed to validate if sensing formats that rely on the proposed nanobodies are indeed capable of discriminating between EOC patients and healthy women.