Phytochelatins, the cornerstone of defence during cadmium exposure in Arabidopsis thaliana, from accute effects to acclimation

Abstract

Bodem- en waterverontreiniging door cadmium (Cd), voornamelijk als gevolg van antropogene activiteiten, is een ernstig probleem dat vele regio’s wereldwijd treft. Hoewel het een toxisch, niet-essentieel element is, nemen planten Cd gemakkelijk op, waardoor fysiologische processen worden verstoord en plantengroei wordt geremd. Bovendien komt Cd op deze manier in de voedselketen terecht. Cadmiumopname in planten vermindert bijgevolg gewasopbrengst en vormt eveneens een risico voor de menselijke gezondheid. In planten is Cd-toxiciteit voornamelijk het gevolg van een indirecte verhoging van de productie van reactieve zuurstofvormen (ROS), waardoor een zogenaamde “oxidative challenge” ontstaat. Naast hun rol als belangrijke signaalmoleculen, kunnen ROS ook schade toebrengen aan cellulaire macromoleculen zoals DNA, eiwitten en lipiden. Om ROS-concentraties onder controle te houden en zo signalering mogelijk te maken en tegelijkertijd oxidatieve schade te voorkomen, beschikken planten over een uitgebreid antioxidatief verdedigingssysteem dat bestaat uit enzymatische en niet-enzymatische componenten. Een van de belangrijkste en meest voorkomende niet-enzymatische antioxidanten is glutathion (GSH). Het is, zowel direct als indirect, betrokken bij de detoxificatie van ROS via de ascorbaat (AsA)- GSH-cyclus. Naast zijn rol als antioxidant, is GSH eveneens betrokken bij de chelatie van Cd. Het heeft een beperkt vermogen tot directe chelatie van Cd, maar belangrijker is dat het de precursor is voor fytochelatines (PCs) die Cd cheleren en in de vacuole sekwestreren. De biosynthese van PCs is een belangrijk proces dat binnen enkele minuten tot uren na blootstelling aan Cd op gang komt in Arabidopsis thaliana planten. Aangezien GSH de bouwsteen is voor PCs, put deze initiële PC-productie het GSH-niveau in de wortels aanzienlijk uit. Bijgevolg beïnvloedt de biosynthese van PCs de cellulaire antioxidatieve capaciteit tijdens de initiële respons op Cd-stress. Het initieert hierbij signaleringsresponsen die acclimatisatie aan Cd-stress aansturen. De meeste informatie over de effecten van Cd-blootstelling op de biosynthese van PCs is afkomstig van korte-termijn blootstellingsstudies. Daarom was het eerste deel van deze studie erop gericht de rol van PCs tijdens langdurige Cd-blootstelling te bepalen (Hoofdstuk 3). Daartoe werden twee verschillende experimentele proefopzetten gebruikt. In het eerste opzet werden wild-type (WT) A. thaliana planten gedurende maximaal drie weken blootgesteld aan Cd om de ontwikkeling van PC-productie op te volgen. In het tweede opzet werden WT en PC-deficiënte “cadmium-sensitive 1-3” (cad1-3) A. thaliana planten gedurende hun volledige levenscyclus fenotypisch opgevolgd na blootstelling aan een reeks Cd-concentraties. In WT-planten namen de PC-gehaltes sterk toe na acute Cd blootstelling en bereikten ze daarna een plateau, wat erop wijst dat PCs aanwezig blijven tijdens de langdurige blootstelling aan Cd. De fenotypische opvolging van WT en cad1-3 mutanten benadrukte het belang van PC-productie voor het overleven en de voortplanting van de plant, aangezien de cad1-3 mutanten, die geen PCs produceren, niet in staat waren zich voort te planten bij blootstelling aan de hoogste Cd-concentratie (5 µM Cd). De cad1-3 planten blootgesteld aan 2 en 5 µM Cd vertoonden een zeer vergelijkbare vegetatieve groeiremming, maar in de planten blootgesteld aan 2 µM Cd bleef er zaadproductie aanwezig, terwijl dit in planten blootgesteld aan 5 µM Cd niet het geval was. Bovendien vertoonden cad1-3 mutanten die aan 0.5 µM Cd werden blootgesteld de minst uitgesproken Cd-geïnduceerde remming van de vegetatieve groei, terwijl hun reproductieve groei vertraagd was en ze uiteindelijk zaden produceerden met een lagere kiemkracht dan die van cad1-3 mutanten blootgesteld aan hogere Cd-concentraties. Naast PCs is het gasvormige hormoon ethyleen een cruciale speler in de regulatie van Cd-geïnduceerde stressreacties. De ethyleenreceptor bevindt zich in het endoplasmatisch reticulum (ER), een organel waarin GSH betrokken is bij het handhaven van een geschikte omgeving voor eiwitvouwing. Om de cruciale rol van GSH, als antioxidant en/of PC-precursor, verder te ontrafelen, werd zijn wisselwerking met ethyleen en de betrokkenheid bij ER-stressreacties tijdens Cd-blootstelling geëvalueerd (Hoofdstuk 4). Daartoe werden Cd-geïnduceerde reacties vergeleken tussen WT A. thaliana planten en glutathion-deficiënte cadmium-sensitive 2 (cad2) en cad1-3 mutanten na 24 u blootstelling. Bij afwezigheid van of bij verminderde PC-productie in, respectievelijk, cad1-3 en cad2 mutanten, was de Cd-geïnduceerde toename in de expressie van oxidatieve stress merkers veel sterker uitgesproken dan in WT planten (Hoofdstuk 4). De sterke toename van Cd-geïnduceerde productie van ethyleen en zijn precursor ACC in beide mutanten suggereert dat vermindering of afwezigheid van PC-geïnduceerde Cd-chelatie leidt tot een verhoogde stressperceptie in aan Cd blootgestelde cad1-3 en cad2 mutanten (Hoofdstuk 4). Aangezien werd aangetoond dat cad1-3 mutanten een beperkte groei vertoonden bij blootstelling aan Cd-stress doorheen hun hele levenscyclus (Hoofdstuk 3), waren we geïnteresseerd in het belang van PCs voor celcyclusprogressie, een basiskenmerk van plantengroei en -ontwikkeling. Eerder onderzoek in de cad2 mutant toonde een rol aan voor GSH in de voortgang van de celcyclus tijdens Cd-blootstelling in A. thaliana. Derhalve werd de betrokkenheid van GSH bij de regulatie van de celcyclus en de DNA-schaderespons, als gevolg van zijn rol als PC-precursor, onderzocht in WT en cad1-3 mutanten tijdens blootstelling aan Cd (Hoofdstuk 5). Hiervoor werd de mate van zowel mitotische celdeling als endoreplicatie in afzonderlijke bladeren van verschillende leeftijden vergeleken tussen beide genotypes tijdens Cd-stress. De verkregen resultaten benadrukken het belang van Cd-chelerende PCs, aangezien zowel celdeling als endoreplicatie sterker werden geremd in bladeren van aan Cd blootgestelde cad1-3 mutanten in vergelijking met het WT. Vergelijkbaar met eerdere bevindingen in cad2 mutanten, werd bij cad1-3 mutanten geen tot beperkte inductie van DNA-schaderesponsgenen waargenomen bij Cd-blootstelling. Dit wijst erop dat in deze mutanten ofwel minder DNA-schade wordt geïnduceerd als reactie op Cd-stress of dat deze mutanten andere strategieën, zoals bijvoorbeeld autofagie, aanwenden om met de Cd-geïnduceerde DNA-schade om te gaan. Samengevat heeft deze studie het belang van PCs tijdens Cd-stress in A. thaliana planten doorheen hun gehele levenscyclus aangetoond. Als Cd-chelatoren zijn PCs belangrijk om zowel de groei en ontwikkeling als reproductie en overleving van A. thaliana tijdens Cd-blootstelling te waarborgen (Hoofdstuk 3). Enerzijds berust dit op de toegenomen verstoring van de celcyclus bij afwezigheid van Cd-chelatie (Hoofdstuk 5). Anderzijds wordt de initiële Cd-geïnduceerde GSH-depletie in wortels, die een alarmsignaalreactie initieert, sterk verstoord in beide mutanten, wat resulteert in verstoorde acclimatisatiereacties met betrekking tot het plantenstresshormoon ethyleen en ER-stress (Hoofdstuk 4). Hoe PCs precies betrokken zijn bij het afstemmen van deze reacties na Cd-blootstelling in verschillende plantenorganen moet echter verder onderzocht worden.