Imaging Strategies to investigate Glycine receptor splicing variant co-assembly and the impact on mobility and function

Abstract

One in five people suffers from chronic pain. This has a negative impact on their health as well as the health care system both from the perspective of the medical costs and by the decreased ability to work of the employee. The glycine receptor (GlyR) in the dorsal horn of the spinal cord regulates pain sensation. In chronic pain models researchers showed a decreased activity of the glycine receptor variant GlyR-α3 through phosphorylation of protein kinase A. For a better understanding and control of chronic pain, researchers search for drugs which restore the activity of the glycine receptor α3. Additionally, for patients with a severe course of temporal lobe epilepsy there is a disturbed balance between the alternative splice variants GlyR-α3L en GlyR-α3K. This supports the need for fundamental research on the molecular properties and mode of action of the GlyR-α3 receptor. Previous research focused on GlyR-α3L and GlyR-α3K individually as homopentameric receptors. However, until this point the heteropentameric receptor containing both GlyR-α3L and GlyR-α3K subunits was not yet studied. The aim of this thesis was to apply microscopy and electrophysiology methods for the study of these heteropentameric receptors. We employed raster image correlation spectroscopy (RICS) and temporal image correlation spectroscopy (TICS) to evaluate the diffusion and interaction of the receptors. Because the presence of spectral crosstalk for a multi-color analysis influences the analysis, we applied alternative excitation for TICS but we could not use this approach for RICS. Therefore, in the first part of the thesis we developed a new fluorescence imaging toolkit named “Raster spectral image correlation spectroscopy (RSICS)”. After validation of the new method in vitro on fluorophores with very similar emission spectrum and for simultaneous analysis of 3 different types of fluorescent molecules in the cytosol of living cells, we demonstrated that the method can be used for a cross-talk free analysis of the non-clustered population of GlyR-α3 receptors and we found interaction or binding of GlyR-α3L and GlyR-α3K. Additionally, GlyR-α3 has the tendency to cluster in the cell membrane. This makes it difficult to perform a quantitative analysis of heteropentameric GlyR-α3L/K. We identified that exclusion of the cluster regions based on intensity thresholding followed by arbitrary region ICS allows investigation of the single receptors. Via brightness analysis of the RICS data and via stepwise photobleaching microscopy analysis, we showed the dependence of receptor hetero-stoichiometry of the relative expression levels. While it was known for GlyR-α3L homopentamers to diffuse slower compared to GlyR-α3K homopentamers, the diffusion speed of heteropentamers is determined by the GlyR-α3K component. Finally, via patch-clamp electrophysiology we showed that the heteromentamer is an electrophysiological active receptor with conductance properties in between of the respective homopentamers. Our hypothesis is that in temporal lobe epilepsy where there is a disturbed ratio between GlyR-α3L and GlyR-α3K resulting in a more equal relative expression level, that in these conditions more heteropentamers could be formed. The intermediate conductance could be a mechanism for fine-tuning the GlyR-function while the increased diffusion speed could have an effect on the subcellular distribution and the turnover rate of the GlyR. Furthermore, the new RSICS method for unbiased protein interaction and mobility analysis has been commercialized in collaboration with company ZEISS under the name “ZEISS spectral RICS” making it available to support more research.

Een op de vijf mensen kampt met chronische pijn. Dit heeft een negatieve invloed op hun eigen gezondheid en ook op de gezondheidszorg door de medische kosten en de daling van productiviteit van de werknemer. De glycine receptor (GlyR) in de dorsale hoorn van het ruggenmerg speelt een rol in pijncontrole. In chronische pijn modellen werd de verlaagde activiteit aangetoond van de glycine receptor variant GlyR-α3 via door proteïne kinase A. Om chronische pijn beter te controleren en begrijpen, zoeken onderzoekers naar drugs die de activiteit van de glycine receptor α3 herstellen. Eveneens werd er in patiënten met een ernstige ziekteverloop van temporale kwab epilepsie een verstoorde verhouding aangetoond tussen de alternatieve splicing varianten GlyR-α3L en GlyR-α3K. Dit ondersteund het belang van fundamenteel onderzoek over de moleculaire eigenschappen en werkingsmechanisme van GlyR-α3 receptoren. Reeds eerder werden GlyR-α3L en GlyR-α3K individueel bestudeerd als homopentamere receptoren, maar heteropentamere receptoren die beide GlyR-α3L en GlyR-α3K subeenheden bevatten werden nog niet eerder bestudeerd. Het doel van deze thesis was om microscopie en elektrofysiologie methoden te gebruiken voor de studie van de heteropentamere receptoren. We gebruikten raster image correlation spectroscopy (RICS) en temporal image correlation spectroscopy (TICS) voor de evaluatie van de diffusie en interactie van de receptoren. Doordat spectrale crosstalk een invloed heeft in multi-kleuren analyse en een risico geeft op vals-positieve resultaten, hebben we alternatieve excitatie gebruikt voor TICS maar dit konden we niet gebruiken voor de RICS metingen Om die reden werd in het eerste deel van de thesis een nieuwe fluorescentie methode ontwikkeld genaamd “Raster spectral image correlation spectroscopy (RSICS)”. Na de validatie dat de methode in vitro kan gebruikt worden op fluoroforen met een erg gelijkaardig emissie spectrum en zelfs voor de gelijktijdige analyse van 3 verschillende types fluorescente moleculen in het cytosol van levende cellen, toonden we aan dat de methode gebruikt kan worden voor analyse van de niet-geclusterde populatie van GlyR-α3 receptoren. In het celmembraan heeft de GlyR-α3 de neiging om te clusteren, dit bemoeilijkt de kwantitatieve analyse van de heteropentamere GlyR-α3L/K. We ondervonden dat het uitsluiten van cluster regio’s gebaseerd op intensiteit begrenzing gevolgd door arbitraire regio ICS het bestuderen van de single receptoren toelaat. Via de helderheid analyse van de RICS data en met behulp van stapsgewijze fotobleking microscopie analyse toonden we aan dat receptor hetero-stoichiometrie afhankelijk is van hun relatieve expressie niveau. Terwijl het gekend is dat GlyR-α3L homopentameren trager diffunderen dan GlyR-α3K homopentameren werd de diffusie snelheid van de heteropentameren bepaald door de GlyR-α3K component. Tot slot werd via patch-clamp elektrofysiologie aangetoond dat de heteropentameer een elektrofysiologisch actieve receptor is met conductantie eigenschappen tussen die van de respectievelijke homopentameren. Onze hypothese is dat voor temporal lobe epilepsy waar de verstoorde verhouding tussen GlyR-α3L en GlyR-α3K resulteert in een meer gelijkaardig relatief expressie niveau, dat hier meer heteropentameren gevormd worden. De intermediaire activiteit kan een mechanisme zijn voor de fine-tuning van de GlyR-functie terwijl de verhoogde diffusie snelheid een effect kan hebben op de subcellulaire verspreiding en de turnover snelheid van de GlyR. Bovendien werd de nieuwe RSICS methode voor de objectieve interactie en beweging analyse van fluorescent gelabelde moleculen gecommercialiseerd in samenwerking met het microscoopbedrijf ZEISS onder de naam “ZEISS spectrale RICS”, wat de methode beschikbaar maakt voor meer onderzoekers.