PDE4D enzymes as a possible therapeutic target to alleviate memory loss in Alzheimer's disease

Abstract

Ongeveer 50 miljoen mensen wereldwijd lijden aan de ziekte van Alzheimer (AD), de belangrijkste oorzaak van dementie. Effectieve behandelingen ontbreken momenteel. De cAMP-PKA-CREB route is cruciaal voor geheugenvorming, waarbij cAMP wordt afgebroken door de PDE-enzymfamilie. Remming van de PDE4-enzymfamilie, met name PDE4D, kan het geheugen verbeteren maar veroorzaakt bijwerkingen. Daarom kan selectieve targeting van PDE4D op isovormniveau (PDE4D1-9) de geheugenconsolidatie verbeteren zonder bijwerkingen. Deze studie heeft als doel het optimaliseren van het transfectieprotocol van de ontworpen CRISPR/Cas9 sgRNA’s voor elk specifiek PDE4D-isovorm in een menselijke neuroblastoma celijn (SH-SY5Y cellen), om uiteindelijk de rol van elk isovorm in neurietlengte en geheugenconsolidatie te ontrafelen. sgRNA’s werden ontworpen, ontwikkeld en geëvalueerd in een celvrije cleavage assay en gelelektroforese. De isovormexpressie in SH-SY5Y cellen werd gecontroleerd met qPCR, met/zonder Aβ. De isovormen PDE4D1 en -7 werden na 48 uur celkweek niet tot expressie gebracht. Het transfectieprotocol werd geoptimaliseerd: 1,75 µL magnetische beads, 500 ng plasmide-DNA van PDE4Dpan, en 30 minuten op de magneet, resulterend in het hoogste Cas9/DAPI-oppervlak (30%). De toediening van puromycine om de getransfecteerde cellen te selecteren moet nog worden geoptimaliseerd, aangezien 1 µg/mL dodelijk is. We kunnen concluderen dat dit transfectieprotocol kan worden gebruikt voor verdere experimenten met betrekking tot geheugenconsolidatie bij AD.