Morphology, functionality and molecular conformation study of CVD diamond surfaces functionalised with organic linkers and DNA.

Abstract

Dit proefschrift kadert in een multidisciplinair project dat de ontwikkeling van diamant-gebaseerde DNA-sensoren beoogt voor diagnostische doeleinden. Het algemene doel is de ontwikkeling van een prototype biosensor, gebaseerd op DNA dat covalent gehecht is aan diamant. Daarbij wordt dezelfde gevoeligheid nagestreefd als bij bestaande methoden, zoals ‘blotting’ technieken, microarrays en polymerase ketting reactie (PCR) gecombineerd met ELISA (enzymelinked immunosorbent assay). Men beoogt de detectie echter te verbeteren op vlak van snelheid en kostprijs: bij voorkeur in real-time, herbruikbaar en eenvoudig te bedienen, zonder labels. Een biosensor is een toestel voor detectie gebaseerd op en/of gericht tegen een biologische component. Specifiek voor een DNA-sensor, bestaat het receptorgedeelte uit een laag van enkelstrengige DNA-probes. Om de receptoren te verankeren en de uitlezing van mogelijke herkenningsreacties (hybridisatie) niet te hypothekeren, worden de receptormoleculen met één uiteinde gehecht aan een fysische drager, de transducer. Deze hechting kan berusten op fysisorptie of covalente bindingen, waarbij meestal eerst een laag van koppelmoleculen aan het oppervlak wordt aangebracht. Als transducer-materiaal is in dit werk gekozen voor diamant verkregen uit chemische damp-depositie (CVD). Zo kan er een zeer sterke, covalente koolstof-koolstof binding gecreëerd worden: dit is nuttig voor de ontwikkeling van een stabiel platform voor herbruikbare biosensoren, eventueel zelfs met continue uitlezing. Bovendien beschikt diamant over gunstige eigenschappen voor zowel detectie berustend op optische als op elektrische signalen. Diamant is namelijk transparant in een breed spectraal gebied en het is een halfgeleider die stabiel is in waterige milieus met een breed elektrochemisch venster. Het eerste doel van deze thesis is de initiële functionalisatie van CVD diamantoppervlakken te realiseren die een covalente en functionele koppeling van biomoleculen aan de transducer toelaat. Dit doel is bereikt door de ontwikkeling van een eenvoudige, reproduceerbare reactie in twee stappen. Vertrekkende van waterstof-getermineerd diamant (door behandeling in een waterstof-plasma) worden er onder 254 nm UV licht onverzadigde vetzuren aangehecht. Aan deze carbonzuren wordt in de tweede stap aminogemodificeerd DNA gehecht, met behulp van een carbodiimide cross-linker (namelijk EDC). De wasstappen, de aangeboden DNA-concentratie en de lengte van de DNA-moleculen zijn nauwkeurig geoptimaliseerd in functie van een zo hoog mogelijke gevoeligheid van de sensor. Deze methode laat toe patronen aan te brengen in de DNA-laag door het gebruik van schaduwmaskers tijdens de xiv fotoreactie met vetzuren. Dergelijke patronen kunnen toegepast worden in een diamant-gebaseerde micro-array met fluorescente uitlezing, of in een elektrische sensor waarbij de probe-laag slechts op welbepaalde plaatsen aangekoppeld mag worden, bijvoorbeeld tussen interdigiterende elektroden. Het tweede doel is de doeltreffendheid van de opeenvolgende oppervlaktebehandelingen na te gaan en de moleculaire organisatie te onderzoeken van de lagen organische koppelmoleculen en DNA. Hiertoe worden de diamantoppervlakken uitgebreid onderzocht met fysische en (bio-)chemische methoden. Gevoeligheid tot op het niveau van puntmutaties is bereikt met enerzijds eindpunt confocale fluorescentiemetingen en anderzijds met een prototype van een real-time, label-vrije elektrische sensor, gebaseerd op impedantie-veranderingen. De conformatie en oriëntatie van de verankerde DNA-moleculen is onderzocht met spectroscopische ellipsometrie in het vacuüm UV, waarbij hoeken van 45° tot 52° zijn gevonden voor de oriëntatie van korte DNA-moleculen (8 tot 36 basen, enkel- zowel als dubbelstrengig) gehecht op ultra-nanokristallijn diamant (UNCD). Deze thesis toont aan dat spectroscopische ellipsometrie in het vacuüm UV gebruikt kan worden om de oriëntatie van DNA-moleculen op CVD diamantoppervlakken te bepalen. Hierbij wordt gesteund op de ruimtelijke richting van de transitie-dipoolmomenten die ontstaan wanneer de DNA-basen geëxciteerd worden door UV-fotonen met een energie van 4.74 eV.