Study of the plasma metabolic phenotype by NMR spectroscopy and evaluation of its ability to detect lung cancer

Abstract

Lung cancer is a major public health concern, accounting for approximately 20% of all cancer-related deaths worldwide. The main challenge of low-dose computed tomography (LDCT) screening, the tool which is currently studied for lung cancer screening, is the high rate of false positive results. Hence, there is an increasing interest in improving the accuracy of current risk models by incorporating lung cancer risk-related biomarkers in order to better select high-risk individuals eligible for LDCT screening. Metabolomics holds great potential for cancer diagnosis as the metabolome reflects alterations in the observed metabolic phenotype. 1H-NMR spectroscopy enables a fast and non-invasive identification of complex mixtures of metabolites with minimal sample preparation and relatively low costs. Therefore, 1H-NMR-based metabolomics represents an appealing option in the search for blood-based diagnostic biomarkers in order to complement current risk models for LDCT screening, thereby decreasing the false positive rate and the corresponding financial burden. First, a 1H-NMR analysis protocol was optimized via metabolite spiking experiments on a medium-field 400 and a high-field 900 MHz spectrometer. Next, a standardized protocol regarding sample handling, which enables the implementation of 1H-NMR-based metabolomics in clinical practice, was developed. Subsequently, it was evaluated whether 1H-NMR-based metabolomics of plasma can be used as a tool to detect lung cancer. It was shown that the plasma metabolic phenotype allows to classify 78% of 233 lung cancer patients and 92% of 226 controls correctly. Moreover, the predictive accuracy of the plasma metabolic phenotype-based classifier was validated in an independent cohort, showing that 98 lung cancer patients and 89 controls can be differentiated with a sensitivity of 71% and a specificity of 81%. The underlying metabolic alterations were identified in an attempt to improve the understanding of the disturbed metabolism of lung cancer. The decreased levels of phospholipids indicate an increased lipogenesis and following membrane synthesis in lung cancer cells, in agreement with the metabolic transformation of cancer cells in order to support the creation of new daughter cells. Surprisingly, the other metabolic changes do not seem to reflect the Warburg effect in cancer cells, but rather the counteraction of the body to the Warburg effect. Although this appears to be a plausible theorem, it should be independently confirmed by more dedicated biochemical studies. In a next step, it was examined whether the plasma metabolic phenotype enables to differentiate between lung and breast cancer. It was demonstrated that the plasma metabolic phenotype enables to classify 93% of 54 female lung cancer patients and 99% of 80 female breast cancer patients correctly. Additionally, the validity of the plasma metabolic phenotype-derived statistical classifier was confirmed in an independent cohort, demonstrating that 60 female breast cancer patients and 81 male lung cancer patients can be discriminated with a sensitivity of 89% (89% of the lung cancer patients were correctly classified) and a specificity of 82% (82% of the breast cancer patients were correctly classified), indicating that breast and lung cancer are characterized by their own, specific metabolite profile. The metabolic alterations responsible for group discrimination were identified in an attempt to explain the differences in the disturbed biochemical pathways between both cancer types. The decreased concentration of sphingomyelin and phosphatidylcholine indicate that the lipogenesis and subsequent membrane synthesis is more pronounced in lung cancer cells as compared to breast cancer cells. These findings are in line with the fact that lung tumors display a higher uptake of the radioactive fluorodeoxyglucose tracer as measured by positron emission tomography, indicating that lung tumors are metabolically more active than breast tumors. Since long, saturated fatty acid chains have very strong Van der Waals interactions, the increased plasma levels of phospholipids with long, saturated fatty acid chains and the decreased plasma levels of phospholipids with short, unsaturated fatty acid chains indicate that the cell membrane of lung tumors is more rigid (less fluid) and less sensitive to lipid peroxidation than that of breast tumors. Afterwards, it was examined whether the plasma metabolome permits to differentiate between lung, breast and colorectal cancer. Preliminary results have shown that the plasma metabolic phenotype-based classifier allows to classify 78% of 37 colorectal cancer patients, 95% of 37 breast cancer patients and 84% of 37 lung cancer patients correctly. Although the number of patients included in this study is still limited, this study provides preliminary evidence that 1H-NMRbased metabolomics of plasma has potential to become a complementary tool to diagnose specific cancer types rather than a common cancer marker Finally, preliminary results of a collaboration between our research group and the group of Biostatistics have shown that the incorporation of plasma metabolic phenotype data in risk models, which only take epidemiological and clinical data into account, reduces the misclassification error of the risk model from 24% to 19%. These findings suggest that the plasma metabolic phenotype has potential to enhance the identification of high-risk individuals eligible for LDCT screening, thereby lowering the false positive rate of LDCT screening and the corresponding financial burden. However, before 1H-NMR-based plasma metabolomics can be applied in routine clinical practice, the study findings need to be independently validated in large-scale studies with asymptomatic, high-risk individuals who are eligible for LDCT screening.

Longkanker is een belangrijke aandoening die verantwoordelijk is voor ongeveer 20% van alle sterfgevallen ten gevolge van kanker wereldwijd. Het voornaamste nadeel van lage dosis computertomografie (LDCT), de methode die op dit moment bestudeerd wordt voor longkankerscreening, is het hoge aantal vals positieve resultaten. Daarom is er steeds meer interesse om de nauwkeurigheid van huidige risicomodellen te verbeteren door biomerkers toe te voegen die verband houden met het risico op longkanker. Op deze manier kunnen individuen die een verhoogd risico op longkanker hebben en aldus in aanmerking komen voor LDCT screening beter geselecteerd worden. Metabolomics heeft veel potentieel om kanker te diagnosticeren omdat het metaboloom een weerspiegeling is van de wijzigingen die gebeuren in het geobserveerde metabole fenotype. Met behulp van 1H-NMR spectroscopie kunnen complexe mengsels van metabolieten op een snelle en nietinvasieve wijze geïdentificeerd worden zonder een uitgebreide staalvoorbereiding en hoge kosten. Daarom is 1H-NMR metabolomics een aantrekkelijke keuze om op zoek te gaan naar diagnostische biomerkers in het bloed die nodig zijn om huidige risicomodellen voor LDCT screening te versterken. Op deze manier zouden het aantal vals positieve resultaten en de overeenkomstige kosten voor de maatschappij gereduceerd kunnen worden. Eerst werd een protocol geoptimaliseerd om bloedplasma te analyseren met 1HNMR spectroscopie. Hiervoor werden spike experimenten uitgevoerd met gekende metabolieten op een spectrometer met een gemiddelde veldsterkte (400MHz) enerzijds en een spectrometer met een hoge veldsterkte anderzijds (900 MHz). Daarnaast werd een gestandaardiseerd protocol met betrekking tot staalverwerking ontwikkeld om de implementatie van 1H-NMR metabolomics in de klinische praktijk toe te laten. Vervolgens werd nagegaan of 1H-NMR plasma metabolomics gebruikt kan worden om longkanker op te sporen. Er werd aangetoond dat het metabole plasma fenotype toelaat om 78% van 233 longkankerpatiënten en 92% van 226 controles correct te classificeren. Bovendien werd de predictieve nauwkeurigheid van het metabole plasma fenotype gevalideerd in een onafhankelijk cohort. Er werd aangetoond dat 98 longkankerpatiënten en 89 controles onderscheiden konden worden met een sensitiviteit van 71% en een specificiteit van 81%. De onderliggende metabole wijzigingen werden geïdentificeerd om het verstoorde longkankermetabolisme beter te kunnen begrijpen. De verlaagde fosfolipidenconcentratie wijst op een verhoogde lipogenese en daaropvolgende membraansynthese in longtumoren. Deze bevindingen kunnen gelinkt worden aan de metabole transformatie die plaatsvindt in tumorcellen om de aanmaak van nieuwe dochtercellen te ondersteunen. Tegen de verwachting in lijken de andere metabole wijzigingen niet overeen te komen met het Warburg effect dat plaatsvindt in tumorcellen. In de plaats daarvan lijken ze de tegenreactie van het lichaam op het Warburg effect te weerspiegelen. Hoewel deze verklaring aannemelijk lijkt, moet ze onafhankelijk bevestigd worden door meer gerichte biochemische studies. In een volgende stap werd onderzocht of het metabole plasma fenotype toelaat om een onderscheid te maken tussen long- en borstkanker. Hierbij werd aangetoond dat het metabole plasma fenotype toelaat om 93% van 54 vrouwelijke longkankerpatiënten en 99% van 80 vrouwelijke borstkankerpatiënten correct te classificeren. Daarnaast werd de validiteit van het metabole plasma fenotype bevestigd in een onafhankelijk cohort. Er werd aangetoond dat er een onderscheid gemaakt kan worden tussen 60 vrouwelijke borstkankerpatiënten en 81 mannelijke longkankerpatiënten met een sensitiviteit van 89% (89% van de longkankerpatiënten worden correct geclassificeerd) en een specificiteit van 82% (82% van de borstkankerpatiënten worden correct geclassificeerd). Deze resultaten tonen aan dat borst- en longkanker gekenmerkt worden door hun eigen, specifiek metaboliet profiel. Vervolgens werden de metabole wijzigingen die verantwoordelijk zijn voor het onderscheid tussen beide groepen geïdentificeerd om de verschillen in de verstoorde biochemische paden tussen beide kankertypes te verklaren. De verlaagde concentraties van sfingomyeline en fosfatidylcholine tonen aan dat de lipogenese en daaropvolgende membraansynthese meer uitgesproken is bij longtumoren dan bij borsttumoren. Deze bevindingen komen overeen met het feit dat longtumoren een hogere opname vertonen van de radioactieve tracer fluorodeoxyglucose op een positron emissie tomografie-scan en bevestigen aldus dat longtumoren metabool meer actief zijn dan borsttumoren. Aangezien lange, verzadigde vetzuurketens zeer sterke Van der Waals interacties hebben, tonen de verhoogde plasmaconcentratie van fosfolipiden met lange, verzadigde vetzuurketens en de verlaagde plasmaconcentratie van fosfolipiden met korte, onverzadigde vetzuurketens aan dat het celmembraan van longtumoren steviger is (lagere fluiditeit) en zodus minder gevoelig is aan lipidenperoxidatie dan het celmembraan van borsttumoren. Bovendien werd bestudeerd of het plasma metaboloom toelaat om long-, borst-, en dikkedarmkanker van elkaar te onderscheiden. Preliminaire resultaten hebben aangetoond dat het metabole plasma fenotype toelaat om 78% van 37 dikkedarmkankerpatiënten, 95% van 37 borstkankerpatiënten en 84% van 37 longkankerpatiënten correct te classificeren. Hoewel het aantal patiënten in deze studie nog beperkt is, tonen deze preliminaire resultaten aan dat 1H-NMR plasma metabolomics potentieel heeft om een complementaire tool te worden die het mogelijk maakt om specifieke kankertypes te diagnosticeren. Ten slotte tonen preliminaire resultaten van een samenwerking met de onderzoeksgroep Biostatistiek aan dat het toevoegen van plasma metaboliet data aan risicomodellen, die voordien enkel rekening hielden met epidemiologische en klinische gegevens, de misclassificatiefout van het risicomodel verlaagt van 24% naar 19%. Deze bevindingen tonen aan dat het metabole fenotype van bloedplasma potentieel heeft om de identificatie van individuen met een verhoogd risico op longkanker, die aldus in aanmerking komen voor LDCT screening, te verbeteren. Op deze manier zou het aantal vals positieve resultaten van LDCT screening en de overeenkomstige kosten voor de maatschappij verminderd kunnen worden. Alvorens 1H-NMR plasma metabolomics toegepast kan worden in de routine klinische praktijk moeten bovenstaande studieresultaten echter nog onafhankelijk gevalideerd worden in grootschalige studies met asymptomatische individuen die een verhoogd risico hebben op longkanker en bijgevolg in aanmerking komen voor LDCT screening.