Construction of a dual display phage system and its applications on real-time label-free biosensing platforms.

Abstract

Biosensors are bioanalytical devices that detect biochemical events between bioreceptor molecules and analytes on the surface of a sensor chip. There are different types of bioreceptors molecules such as enzymes, antibodies, peptides, whole cells and microorganisms that are used. Phage are considered as good bioreceptor molecules due to their unique property of displaying different target specific peptides as fusion coat proteins on their surface. Phage display has become a valuable high throughput technique in molecular biology, where it allows the display of foreign peptides by inserting cDNA of the peptide of interest in one of the coat proteins genes. Although, this technology was being exploited for displaying biomarkers for different diseases, most of the phage-based assays are carried out using phage ELISA protocols. Therefore, there is a need to develop new strategies to apply phage displaying biomarkers on biosensing platforms in order to achieve fast measuring devices with an increased sensitivity. In order to provide a solution for this, we developed a dual display phage system displaying a disease specific biomarker at one end (pVI) and a capturing protein at the opposite end (pVII) of an M13 phage using helper plasmid and phagemid systems. As a proof of concept, we used an autoantigenic biomarker (UH_RA.21) binding to autoantibodies present in patients with Rheumatoid Arthritis. Streptavidin binding protein (SBP) was used as a capturing protein. The helper plasmid mimics a helper phage infection, but it provides only the wild type proteins to the progeny phage in the phage packaging process. Hence only recombinant phage genomes are incorporated in the produced phage resulting in genetically pure phagemid. In our dual display system, both the biomarker and the capturing protein are designed to be displayed at the opposite ends of the M13 phage. This is expected to provide a directed orientation of the resulting phage in sensing platforms with protruding biomarker phage ends. This way an increase in the sensitivity of the assay can be achieved. Our results do prove the hypothesis that the proposed dual display system provides higher sensitivity in phage ELISA protocols when comparing to the conventional single display phage system. Indeed a significant difference between borderline positive patient serum samples and negative control serum samples could be demonstrated, while this is not possible using conventional phage ELISA approaches. Hence, our dual display system is a good alternative tool for the early stage diagnosis of the disease as described in chapter three. The proposed dual display phage based approach has been applied to different biosensing platforms. To achieve this two different strategies were used for the screening of autoantibodies in serum samples. Firstly, the dual display phage is immobilized on the surface of the sensor to capture the autoantibodies present in serum samples. Secondly a phage complex using magnetic beads was isolated from serum samples and these complexes were captured by the biosensor surface using anti-human IgG antibodies. In chapter four, real-time immobilization of phage has been monitored in rapid, label-free and high sensitive sensing platforms such as SPR and QCM-D. In the QCM-D platform STV functionalized plain gold crystals and biotinylated gold crystals were used for the immobilization of phage. In both platforms we demonstrated the efficient binding of SBP displaying phage SR 21 and SB and not the non SBP displayers (CR 21 and CB). Moreover in QCM-D, we have also confirmed that the orientation of the phage on the sensor surface is in a likely vertical orientation as deduced from the viscoelastic properties of the layer. The same pattern of results was obtained for the STV functionalized SA sensor chips on the SPR Biacore T200. Chapter five deals with the screening of autoantibodies in positive patient serum samples using SPR, QCM-D and heat transfer resistant Rth or HTM setups. Interestingly in all experiments on the QCM-D and SPR platforms, positive patient serum complexes binds significantly more to anti-human IgG coated surfaces than the so called negative complex from negative serum samples. Also in the case of HTM or Rth, the positive complex samples produced initial a higher HTM signal on functionalized NCD as compared to the negative complex. While QCM-D measurements are highly reliable and reproducible, SPR and HTM were less reproducible. Both SPR and HTM approaches require optimization. In conclusion, we succeeded in constructing a dual display phage system displaying an autoantigenic target at one end and a capturing peptide on the opposite end using a phagemid and a helper plasmid based approach. The proposed dual display phage have shown high sensitivity in phage ELISA assays, allowing for the detection of autoantibodies in borderline positive patient serum samples that could not be detected in conventional phage ELISA procedures. This way the developed approach is a better alternative for the conventionally used single display based phage ELISA in the qualitative screening for autoantibodies. Since we designed the dual display phage with exchangeable cassette like displaying constructs, the exchange of both displayed peptides (capturing and biomarkers) in the future is easily achieved. Moreover, phage are easy to prepare, are inexpensive as compared to the conventional antibodies and do show a high stability. The developed dual display phage have been applied successfully in different sensing platforms (QCM-D, SPR and HTM) and all platforms allow to discriminate between autoantibody containing serum and negative control serum samples. However the proposed phage based biosensors are not yet ready for development of a point of care diagnostic tool. But the dual display system we have reported here, can be the method of choice for such a biosensor development because our approach gives smaller than normal phage and it reduces the aspecificity by allowing sample purification from a complex mixtures and gives rise to a significant increase is sensitivity as demonstrated by the identification of borderline positive patient samples. We anticipate that these results could open exciting opportunities for the use of dual display phage in the qualitative screening for autoantibodies in the patient samples.

Een biosensor is een bioanalytisch toestel dat biochemische reacties detecteert tussen bioreceptormoleculen en een analyt aan het oppervlak van de transducer. Er bestaan verschillende types bioreceptormoleculen zoals enzymen, antilichamen, peptides, ganse cellen en micro-organismen. Recent kwamen fagen onder de aandacht als potentieel goede bioreceptormoleculen aangezien zij verschillende targetspecifieke peptides op hun oppervlak tot expressie kunnen brengen. Faagdisplay wordt beschouwd als een highthroughput techniek in de moleculaire biologie. Allerhande peptides kunnen tot expressie gebracht worden door het inbrengen van cDNA van het peptide van interesse in het genoom van één van de faag manteleiwitten. Deze technologie werd gebruikt om biomerkers voor diverse ziektes tot expressie te brengen, maar de meeste faag gebaseerde testen blijven tot dusver beperkt tot ELISA’s. Er is een strategie vereist om ze te integreren in een biosensorplatform met als doel snelle testen met een hoge sensitiviteit te bereiken. Om hier een oplossing voor te bieden, hebben wij in dit werk een dubbel faagdisplay systeem ontwikkeld. Deze presenteert een ziekte specifieke biomerker (pVI) aan het ene uiteinde van de faag en een capture eiwit (pVII) aan het andere uiteinde. Als een proof-of-concept hebben we gebruik gemaakt van het autoantigene target (UH_RA.21) specifiek voor rheumatoïde arthritis, eerder ontwikkeld door Prof. Somers aan de UHasselt als biomerker. Als capture eiwit maken we gebruik van het streptavidine bindend proteïne (SBP). Voor de dubbele faagdisplay werd gebruik gemaakt van een helper plasmide en faagmid systeem. Het helper plasmide systeem bootst de helper faag na en zorgt tijdens de produktie van fagen enkel voor de aanmaak van de wild-type faageiwitten. Bijgevolg helpt dit helper plasmide systeem bij het maken van een genetisch zuivere faagmid. Bij het dubbele faagdisplay systeem worden de biomerker en het SBP gepresenteerd aan de tegenovergestelde uiteinden van de faag. Hierdoor verwachten we een goede verticale oriëntatie in een biosensor platform, hetgeen het aantal gebonden fagen op het sensoroppervlak verhoogd en bijgevolg ook de gevoeligheid van de sensor kan verhogen. Zoals verwacht gaf ons dubbel faagdisplay systeem een hogere gevoeligheid in ELISA protocols in vergelijking met de conventionele enkele faagdisplay systemen. Dit werd bevestigd doordat een significant verschil tussen de “borderline” positieve serum stalen en de negatieve serum controle kon gemeten worden, hetgeen niet mogelijk is in de conventionele assays. Dit systeem kan bijgevolg gebruikt worden als een goed hulpmiddel voor een vroege opsporing van een ziekte, zoals verder wordt bediscussieerd in hoofdstuk 3. De dubbele faagdisplay biosensor werd gebruikt in combinatie met verschillende detectieplatformen. In hoofdstuk 4 gaat men verder in op de ontwikkeling van een SBP display gebaseerde faag probe. Dit werd gedaan met de state-of-the-art methoden SPR en QCM-D. In beide gevallen gaven SBP bevattende fagen SR21 en SB een hogere respons in vergelijking tot de SBP negatieve faagpreparaten CR 21 en CB. De faagbinding werd in real-time gemonitord met behulp van de hoger genoemde biosensor opstellingen. Bovendien kon met behulp van de QCM-D tevens de verticale orientatie van een faag op de STV gefunctionaliseerde sensor oppervlakken aangetoond worden. In hoofdstuk 5 werd gescreend voor de aanwezigheid van autoantilichamen in positieve serum stalen van patienten op SPR, QCM-D en in heat transfer resistance (Rth) opstellingen. De gevormde positieve serum complexen binden meer aan de anti-mens IgG gecoate oppervlakken in alle experimenten uitgevoerd op QCM-D en SPR. In Rth, produceren de positieve complex gefunctionaliseerde NCDs een hogere initiële respons in vergelijking met de negatieve complexen. De QCM-D resultaten waren in hoge mate reproduceerbaar en dus beter betrouwbaar in vergelijking tot de SPR en Rth data die meer optimalisatie vereisen. Deze experimenten bevestigen dat de door ons ontwikkelde dubbele faagdisplay gebaseerde biosensor assays een beter alternatief zijn voor de conventioneel gebruikte faag ELISA om autoantilichamen in patiënten serum te screenen. Het dubbele faagdisplay platform zoals voogesteld bestaat uit een cassette structuur die op eenvoudige wijze de uitwisseling van de biomerker(s) en het capture peptide mogelijk maakt. Fagen zijn tevens gemakkelijk aan te maken, budgetvriendelijk in vergelijking met conventionele antilichamen en ze tonen een hogere stabiliteit. De faag gebaseerde sensoren zijn nog niet klaar om gecommercialiseerd te worden of om verder ontwikkeld te worden tot point of care diagnostische testen. De grootte van de faag en zijn aspecifieke bindingskarakteristieken verlagen de kansen om het te gebruiken als specifieke affiniteitsmoleculen in sensor ontwikkeling. Het systeem dat hier gerapporteerd werd, kan fagen in sensor platformen integreren, ondermeer door het kleiner formaat in vergelijking met een normale faag en het verlaagd risico op aspecifieke binding door de opzuivering uit complexe stalen. Het dubbele display systeem door ons voorgesteld zou in de toekomst uitgebreid kunnen worden naar verschillende biomerkers gebaseerd op het pVI display systeem. Het is ook belangrijk te overwegen om pVIII display van SBP op te zetten om een beter signaal in een SPR sensor te bereiken. De optimalisatie van de Rth en SPR platformen is nodig voor de screeningsassays van autoantilichamen. Ook zou het interessant kunnen zijn om de biomerkers in een helper plasmide gebaseerd systeem te gebruiken in plaats van een faagmid. Dit kan zorgen voor een verhoogde expressie op de faag, waardoor de gevoeligheid kan verhogen. Uiteindelijk kan een multi-biomerker systeem (dubbel faagdisplay, die verschillende biomerkers presenteert) gebruikt worden in een array voor een complete diagnose van RA.